Här presenterar vi en förbättrad jäst en-hybrid screening protokoll för att identifiera de transkriptionsfaktorer (TFs) som kan binda till en mänsklig DNA-region av intresse. Denna metod använder en hög genomströmning screening pipeline som kan förhöra bindningen av > 1 000 TFs i ett enda experiment.
Identifiera uppsättningarna av transkriptionsfaktorer (TFs) som reglerar varje mänsklig gen är en svår uppgift som kräver att integrera ett flertal experimentella och kalkylmässiga metoder. En sådan metod är den jäst en-hybrid (Y1H) analys, i vilken interaktioner mellan TFs och DNA testas regioner i miljön av jäst kärnan med hjälp av reporter gener. Y1H analyser innebär två komponenter: ett ‘DNA-bete’ (e.g., initiativtagare, smakförstärkare, ljuddämpare, etc.) och en ‘TF-byte’ vilket kan undersökas för reporter gen aktivering. Mest publicerade protokoll för att utföra Y1H skärmar är baserade på omvandla TF-prey bibliotek eller matriser till DNA-bete jäststammar. Här beskriver vi en rörledning, kallas utökade Y1H (eY1H)-analyser, där TF-DNA interaktioner är under parning DNA-bete stammar med en klädd samling av TF-prey stammar med en hög densitet matris (HDA) robotic plattform som tillåter screening i en 1,536 koloni-format. Detta ger en dramatisk ökning genomströmning (60 DNA-bete sekvenser mot > 1000 TFs tar två veckor per forskare) och reproducerbarhet. Vi illustrerar de olika typerna av förväntade resultat av provning mänskliga arrangören sekvenser mot en rad 1 086 mänskliga TFs, samt exempel på problem som kan uppstå under skärmar och felsökning av dem.
Ett centralt problem i det biomedicinska fältet är att fastställa de mekanismer genom vilka varje mänsklig gen regleras. Transkription är det första steget i Kontrollera gen uttryck nivåer, och det är reglerat av uppsättningar av transkriptionsfaktorer (TFs) som är unika för varje gen. Med tanke på att människor koda för > 1 500 TFs1,2, identifiera komplett uppsättning av TFs som styr uttrycket av varje gen fortfarande en öppen utmaning.
Två typer av metoder kan användas för att mappa TF-DNA interaktioner: TF-centrerad och DNA-centrerad metoder3 (figur 1A). I TF-centrerad metoder, är en TF sevärdheter utforskad för bindning till genomisk DNA regioner eller för att avgöra dess DNA bindande särart. Dessa metoder inkluderar kromatin immunoprecipitation (ChIP) följt av hög genomströmning sekvensering, protein bindande microarrays och SELEX4,5,6. I DNA-centrerad metoder, är en DNA-sekvens av intresse utforskad för att avgöra uppsättningen TFs som binder till DNA-sekvensen. Den mest allmänt tillämpad av sådana metoder är jäst en-hybrid (Y1H) analyser, i vilka interaktioner mellan TFs och DNA testas regioner i miljön av jäst kärnan med reporter gener7,8,9.
Y1H analyser innebär två komponenter: ett ‘DNA-bete’ (t.ex. initiativtagare, smakförstärkare, ljuddämpare, etc.) och en ‘TF-byte’ vilket kan undersökas för reporter gen aktiveringen9,10 (figur 1B). DNA-betet är klonade uppströms av två reporter gener (Lindholm och HIS3) och båda DNA-bait::reporter konstruktioner är integrerade i jäst genomet att generera chromatinized ‘DNA-bete stammar.’ TF-bytet, kodade i en plasmid som uttrycker en TF smält till domänen aktivering (AD) av jäst Gal4 TF, införs i den DNA-bete stammen att fiska för TF-DNA interaktioner. Om TF-bytet binder till DNA-bete sekvensen, kommer då annonsen i TF-bytet leda till aktivering av både reporter gener. Celler med en positiv interaktion kan därför väljas för tillväxt på plattor saknar histidin, samt övervinna en kompetitiv hämmare, 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT), och visualiseras som blå kolonier i närvaro av X-gal. Eftersom den potenta jästen Gal4 AD används, Y1H analyser kan upptäcka interaktioner mellan transkriptionell aktivatorer samt kvinnoförtryckarna. Dessutom, med tanke på att TF-bytesorganismer uttrycks från en stark jäst promotor (ADH1), kan interaktioner upptäckas även för TFs som har låga endogena uttryck nivåer, vilket är en utmaning för att upptäcka av ChIP11,12.
Mest publicerade protokoll för att utföra Y1H analyser bygger på att införa TF-bytesorganismer i de DNA-bete jäststammar genom att omvandla poolade TF-prey bibliotek följt av urval, koloni plocka och sekvensering att identifiera samverkande TF, eller omvandla enskilda kloner8,9. Detta är tidskrävande protokoll, begränsning av antalet DNA-sekvenser som kan testas per forskare. En nyligen förbättring av Y1H analyser, kallas enhanced Y1H (eY1H), har dramatiskt ökat dataflödet som screening med en hög densitet matris (HDA) robotic platform för att para jäststammar DNA-bete med en samling av jäststammar varje uttrycker en annan TF-byte10,13 (figur 1 c). Dessa skärmar anställa en 1 536 kolonin format gör det möjligt att testa de flesta mänskliga TFs i fyra exemplar med endast tre plåtar. Vidare, med tanke på att TF-DNA interaktioner är testade på parvisa sätt, detta tillvägagångssätt möjliggör jämföra interaktioner mellan DNA-beten (såsom två kodande enda nukleotid varianter) och mellan olika TFs eller TF varianter11,12 ,14.
Använder eY1H analyser, har vi beskrivit de största mänskliga och Caenorhabditis elegans DNA-centrerad TF-DNA interaktioner nätverk till-datum. I synnerhet har vi identifierat 2.230 interaktioner mellan 246 mänskliga utvecklingsmässiga smakförstärkare och 283 TFs12. Vidare har vi anställt eY1H analyser att avslöja förändrad TF bindning till 109 enda nukleotid kodande varianter associerade med genetiska sjukdomar såsom utvecklingsmässiga missbildningar, cancer och neurologiska sjukdomar. Mer nyligen, vi brukade eY1H avgränsa ett nätverk bestående av 21,714 interaktioner mellan 2 576 C. elegans gen promotorer och 366 TFs11. Detta nätverk bidrog till att avslöja den funktionella rollen av dussintals C. elegans TFs.
Protokollen till generera DNA-bete fläckar och utvärdera av bakgrunden reporter verksamhet har varit rapporterade någon annanstans15,16,17. Här beskriver vi ett eY1H pipeline som kan användas till skärmen någon mänsklig genomisk DNA regionen mot en rad 1 086 mänskliga TFs. När en jäst DNA-bete stam genereras och en TF-byte-matris är fläckig på motsvarande plattorna, kan hela protokollet utföras i två veckor (tabell 1). Viktigare, kan protokollet vara parallelized så att en enskild forskare kan skärmen 60 DNA-bete sekvenser samtidigt. För att demonstrera protokollet, vi initiativtagarna till två cytokingener CCL15 och IL17F. Dessutom visar vi resultat från misslyckade skärmar för att illustrera vilka typer av problem som kan uppstå när du utför eY1H analyser och felsökning av dem.
Den robotic eY1H parning screening metod som beskrivs här kraftigt ökar genomflödet för att identifiera uppsättningen av TFs som binder till en DNA-region av intresse, jämfört med tidigare bibliotek screening eller klädd screening metoder som bygger på omvandling. Ytterligare, TF-DNA interaktionen upptäcks av eY1H analyser finns mycket reproducerbara som 90% av interaktioner upptäckt positiva för alla fyra kolonier testas per TF, och 90% av interaktioner testa i en oberoende skärmen i samma jäst DNA-bete st…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av National Institutes of Health [R35-GM128625 till J.I.F.B.].
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |