Medium-throughput Screening analyser för bedömning av effekter på Ca2 +-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier

Summary

Här, två medium-genomströmning analyser för bedömning av effekter på Ca^{2 +}-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier beskrivs. Dessa analyser kan användas för att snabbt och enkelt skärmen stora mängder föreningar för effekter på Ca^{2 +}-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier.

Abstract

Ca^{2 +}-signalering är nödvändig för normal spermie funktion och manlig fertilitet. Likaså är akrosomen reaktionen avgörande för möjligheten för en mänsklig spermie att penetrera zona pellucida och befrukta ägget. Det är därför av stort intresse att testa föreningar (t.ex. miljö kemikalier eller läkemedelskandidater) för sin effekt på Ca^{2 +}-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier antingen att undersöka de potentiella negativa effekterna på människors spermie funktion eller att undersöka en möjlig roll som preventivmedel. Här beskrivs två medium-kapacitet idag: 1) en fluorescens-baserad analys för bedömning av effekter på Ca^{2 +}-signalering i mänsklig sperma och 2) en bild flödescytometrisk analys för bedömning av akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessa analyser kan användas för att screena ett stort antal föreningar för effekter på Ca^{2 +}-signalering och akrosomen reaktion i mänskliga spermier. Dessutom kan analyserna användas för att generera mycket specifika dos-responskurvor för enskilda föreningar, bestämma potentiella additivitet/synergier för två eller flera föreningar, och att studera farmakologiska verkningsmekanism genom kompetitiv hämning experiment med CatSper-hämmare.

Introduction

Syftet med de två analyser som beskrivs här är att undersöka påverkan på Ca^{2 +}-signalering och akrosomen reaktion i mänsklig sperma, som har visats för flera föreningar i flera publikationer anställa dessa analyser^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-signalering och akrosomen reaktionen är både viktigt att normala mänskliga spermie funktion och manlig fertilitet.

Det övergripande målet för en mänsklig spermie är att befrukta ägget. För att kunna framgångsrikt och naturligt befrukta ägget, måste funktioner i cellen spermier regleras ordentligt under resan av spermier cellen genom den kvinnliga genitalia^8,9. Många av funktionerna spermie regleras via den intracellulära Ca^{2 +}-koncentration [Ca^{2 +}]_jag (t.ex. spermier motilitet, Kemotaxis och akrosomen reaktion)¹⁰. En mognadsprocess som kallas capacitation, som återger spermie som gödning ägget, är också delvis reglerat av [Ca^{2 +}]_jag¹⁰. Ca^{2 +}-strängpressning Ca^{2 +}-ATPas pumpar¹¹ upprätthålla ett ungefärligt 20.000 gånger Ca^{2 +}-gradient över mänskliga spermier cellmembranet, med en vilande [Ca^{2 +}]_jag 50-100 Nm. Om Ca^{2 +} tillåts korsa cellmembranet (t.ex. genom öppnandet av Ca^{2 +}-kanaler), ett betydande inflöde av Ca^{2 +} uppstår, ger upphov till en höjd av [Ca^{2 +}]_jag. Dock spermie också bär intracellulära Ca^{2 +}-butiker, som kan frigöra Ca^{2 +} och, därför, också ger upphov en höjd av [Ca^{2 +}]_i¹². Intressant, alla kanal-medierad Ca^{2 +}-inflöde i mänskliga spermaceller har hittills konstaterats för att ske via CatSper (CatJoniska kanal SpeRM), som uttrycks endast i spermierna¹¹. I mänskliga spermaceller, CatSper aktiveras av endogena ligander progesteron och prostaglandiner genom distinkta ligand bindande platser^13,14,15, leder till en snabb Ca^{2 +}-inflöde till cellen spermier. Två huvudsakliga källor nära ägget ger höga nivåer av dessa endogena ligander. En är den follikulära vätska som innehåller höga halter av progesteron¹⁶. Den follikulära vätskan frigörs från mogna folliklar tillsammans med ägget vid ägglossningen och mixar med vätska inom den oviducts¹⁷. Andra huvudkällan är den cumulus celler som omger ägget och släppa höga nivåer av progesteron och prostaglandiner. Progesteron-inducerad Ca^{2 +}-inflöde i spermacellerna har visat att medla chemotaxis mot ägg^9,18, kontrollera spermier motilitet^19,20 och stimulera akrosomen reaktion²¹. Utlösning av dessa enskilda [Ca^{2 +}]_jag-reglerade spermier funktioner i rätt ordning och vid rätt tidpunkt är avgörande för befruktning av ägg⁸. I linje med detta, en suboptimal progesteron-inducerad Ca^{2 +}-inflöde har hittats ska associeras med minskad fertilitet^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} och funktionella CatSper är avgörande för manlig fertilitet^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Som spermacellerna nå ägget, ett händelseförlopp måste äga rum för befruktning att inträffa: (1) spermacellerna måste penetrera det omgivande cumulus celllagrar, 2) binder till zona pellucida, 3) exocytose acrosomal innehåll, så kallade akrosomen reaktionen ³⁷, 4) penetrera zona pellucida och 5) säkring med ägg membranet att slutföra befruktning³⁸. För att kunna gå igenom dessa steg och befrukta ägget, måste spermie först genomgå capacitation¹¹, som börjar som spermacellerna lämnar sädesvätskan som innehåller ”decapacitating” faktorer³⁹ och simma in i vätskorna av kvinnliga fortplantningsorganen med höga nivåer av bikarbonat och albumin³⁷. Capacitation återger spermacellerna kan genomgå en överaktivering, en form av motilitet med kraftig stryk av Flagellen och akrosomen reaktion³⁷. Hyperactivated motilitet krävs för genomträngningen av zona pellucida⁴⁰, och akrosomen innehåller olika Hydrolytiska enzymer som stöd denna penetration processen⁴¹. Dessutom återger akrosomen reaktionen spermacellerna kan fusing med ägg genom att exponera specifika membranproteiner på spermier ytan krävs för sperma-ägg fusion⁴². Möjligheten att genomgå överaktivering och akrosomen reaktion är följaktligen båda krävs för framgångsrik befruktning av ägg^40,42. Tvärtemot vad har setts för mus sädesceller^43,44,45, kan endast mänskliga spermaceller som är akrosomen-intakt binda till de zona pellucida⁴⁶. När de mänskliga spermacellerna är bundna till zona pellucida måste de genomgå akrosomen reaktionen både penetrera zona pellucida⁴¹ och att exponera specifika membranproteiner som behövs för att fusionen med det ägg³⁸. Tidpunkten för akrosomen reaktionen i mänskliga spermier är således avgörande för befruktning ska ske.

Som beskrivits ovan, Ca^{2 +}-signalering är avgörande för normala spermier cell funktion⁸, och det är därför av stort intresse att kunna skärmen ett stort antal föreningar för effekter på Ca^{2 +}-signalering i mänskliga spermaceller. På samma sätt som bara mänskliga spermaceller som genomgår akrosomen reaktion vid rätt tid och plats kan penetrera zona pellucida och gödsla den ägg^46,47, är det också av stort intresse för att kunna testa föreningar för sin förmåga att påverka akrosomen reaktionen i mänskliga spermier. I detta syfte beskrivs två medium-throughput screening analyser: 1) test för effekter på Ca^{2 +}-signalering i mänskliga spermaceller, och 2) test för förmågan att inducera akrosomen reaktion i mänskliga spermaceller.

Analys 1 är en medium-genomströmning Ca^{2 +}-signalering assay. Denna fluorescens plate reader-baserad teknik övervakar ändringar i fluorescens som funktion av tiden samtidigt i flera brunnar. Den Ca^{2 +}-känsliga fluorescerande färgämne, Fluo-4 har en K-_d för Ca^{2 +}≈ 335 nM och är cell-diffusionskoefficient i AM (acetoximetyl) ester form. Med Fluo-4, är det möjligt att mäta förändringar i [Ca^{2 +}]_i över tid och efter tillsats av föreningar av intresse för spermacellerna. Analysen har utvecklats av labbet av Timo Strünker 2011¹³ och har sedan använts i flera studier att skärmen föreningar för effekter på Ca^{2 +}-signalering i mänskliga spermier^{1,2,3, 4,5}. En liknande metod har också använts till skärmen flera drog kandidater⁴⁸. Dessutom är denna analys också användbart för att bedöma på farmakologiska verkningssätt åtgärd^1,2,3,4,5, DOS-respons kurvor^{1, 2,3,4,5}, kompetitiv hämning^1,2, additivitet^1,2och synergism³ av föreningar av intresse.

Analysen 2 är en medium-genomströmning akrosomen reaktion analysen. Denna bild cytometer-baserad teknik mäter mängden livskraftig akrosomen reagerade sädesceller i ett prov, med tre fluorescerande färger: propidium jodid (PI), FITC-kopplade lektin Pisum sativum (FITC-PSA) och Hoechst-33342. Analysens ändrades från ett liknande flöde flödescytometri-baserade metoden av Zoppino et al.⁴⁹ och har använts i flera studier^6,7. När det gäller de Ca^{2 +}-signalering assay, denna akrosomen reaktion analys kunde också användas för att bedöma dos-responskurvor, hämning, additivitet och synergier av föreningar av intresse.

Protocol

Insamling och analys av human sädesvätska prover i protokollen följer riktlinjerna i den forskningsetisk kommitté av Danmarks huvudstad regionen. Alla sperma prov har erhållits efter informerat samtycke från frivilliga givare. Efter leverans, var proverna helt anonymiserade. Varje givare fått en avgift på 500 DKK (ca $75 US-dollar) per prov för sina besvär. Proverna analyseras samma dag som leverans och sedan förstöras omedelbart efter laboratorieförsök. Obs: Medium genomströmni…

Representative Results

Representativa resultat från experiment testa effekten av 4 föreningar (A, B, C och D) tillsammans med en positiv (progesteron) och negativa (buffert) kontroll på [Ca2 +]jag i mänskliga spermier med hjälp av medium-genomströmning Ca2 +-signalering analysen kan ses i figur 4a. I figur 4bvisas en dos-responskurva av progesteron, som härrörde från peak ΔF/F0 (%) data som inducera…

Discussion

Den medelstora genomströmning Ca^{2 +} signalering analysen baseras på mätningar av fluorescens från enda mikrobrunnar varje innehållande omkring 250.000 sädesceller. Fångade signalen är i genomsnitt från alla enskilda sädesceller i brunnen. Analysen ger således ingen rumslig information om var specifikt i den spermie [Ca^{2 +}]_jag har ändrats, i hur stor andel av de spermier som en förändring i [Ca^{2 +}]_jag äger rum, eller hur heterogena svar är mellan de en…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer