Att fastställa ägg befruktning Bemisia tabaci med en Cytogenetisk teknik
Summary
Vi presenterar en enkel cytogenetiska teknik med 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) för att fastställa vilken gödsling och primära könskvot av haplodiploid invasiva skadedjur Bemisia tabaci.
Abstract
Några arter av sap-sugande Vita flygare är några av de mest skadliga terrestrial skadedjur i hela världen på grund av gröda skador de förorsakar och växt virus de vektor. Trots många studier av biologi av dessa arter i olika miljöer, en nyckel livshistoria parameter, avkomma sex nyckeltal, har fått lite uppmärksamhet, men är viktigt för att förutsäga populationsdynamik. Den primära könskvot (sex ratio på oviposition) av Bemisia tabaci har aldrig rapporterats men kan hittas genom att bestämma andelen ägg befruktning av denna haplodiploid insekt. Tekniken innebär att dechorionation ägg med blekmedel, en serie fixering steg och tillämpningen av allmänna DNA fluorescerande fläcken, DAPI (4, 6-diamidin-2-fenylindol, ett DNA-bindande fluorescerande färgämne), binda till kvinnliga och manliga pronuclei. Här presenterar vi tekniken, och ett exempel på dess tillämpning, att testa om en endosymbiotic bakterie, Rickettsia sp. nr. bellii, påverkat den primära könskvot av B. tabaci. Denna metod kan hjälpa i befolkningsstudier av Vita flygare, eller för att avgöra om sex fördelning finns med vissa stimuli från omgivningen.
Introduction
Studien av sex tilldelning, eller relativa investeringen i manliga och kvinnliga avkomma, är en hörnsten i beteendeekologi1,2,3. Förutom dess makt för att testa adaptiv modeller av beteende, kan att veta kön fördelning strategi en organism förbättra modeller av dess populationsdynamik. Hos många arter styrs sex fördelningen av mödrar. För att avgöra kön fördelning, är det viktigt att fastställa den primära könskvot eller andelen honor vid tidpunkten för ägg nedfall. Även om sex förhållandet på vuxen uppkomst kan ge ledtrådar till sex tilldelningen, kan differentiell utvecklingsmässiga dödlighet mellan manliga och kvinnliga ungfisk ofta skeva förhållandet adult sex väsentligen. I vissa arter av Hymenoptera, ordning insekter som innehåller myror, bin och getingar, har den primära könskvot bestämts med cytogenetiska analyser, färgning embryon för att Visa genetiska DNA. Eftersom hymenopterans är haplodiploid, ett begynnande manliga ägg är haploida och innehåller bara de kvinnliga pronucleus (n), medan begynnande kvinnliga ägg är diploida och innehåller både manliga och kvinnliga pronuclei (2n). Även om Aleyrodidae, familjen sap-utfodring av true Halvvingar, känd som Vita flygare, är också haplodiploid, har inte ett etablerat test att hitta den primära könskvot i dessa insekter. Detta är kanske förvånande med tanke på intensiteten i studie av några kosmopolitiska allvarliga skadedjur i denna familj och vikten av sex nyckeltal i konkurrenskraftiga interaktioner av Vita flygare4,5,6,7 ,8,9,10 och populationsdynamik generellt. I haplodiploid insekter också är sex nyckeltal otvungen av sex beslutsamhet system, så att möjligheten till selektiv befruktning och labila sex nyckeltal som varierar med den miljö2. Här presenterar vi en teknik för att fastställa den primära könskvot av arter komplex av Vita flygare kollektivt kallas den sweetpotato mjöllus, B. tabaci. Här en art omfattar mer än 28 arter världen över11och omfattar några av de mest skadliga globala invasiva skadedjur12,13. Tillämpningen av denna teknik att avgöra kön fördelning mönster i B. tabaci och andra Aleyrodidae kommer att tillåta en mer noggrann undersökning av variabler, inklusive temperatur, värdväxt, endosymbiotic bakterier eller växt/mjöllus patogener, som kan påverka mjöllus primära sex nyckeltal och mjöllus populationsdynamik.
Vi är omedvetna om någon jämförbar ägg-färgning tekniker för B. tabaci. Protokollet är bekvämt jämfört med färgning metoder som används för andra insekters ägg14 som det utelämnar en övernattning fixering steg och, därför, kan slutföras inom 3 h. Som ett exempel på ett program, en endosymbiotic bakterie, Rickettsia sp. nr. bellii, förknippas med kvinnlig bias i vårt laboratorium linjer B. tabaci Mellanöstern-Asien mindre 1 (MEAM1)15,16. I en B. tabaci MEAM1 laboratorium linje (”MAC1”, samlas in från Maricopa Agricultural Center), vi testar om Rickettsia-infekterade (R+) Honor gödsla mer ägg än oinfekterade (R–) Honor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är först med att fånga befruktning skattesatsen eller primära könskvot av B. tabaci. Utmaningen med detta protokoll är att den kräver forskare att lära sig hantera mjöllus äggen snabbt, att se till att inte mer än 1 h förflutit sedan äggen var oviposited tills de är fasta. Under preliminära experiment var ägg som fastställdes till 3 h eller mer postoviposition för gammal för att följa befruktning, som syngamy hade inträffat och mitotiska divisioner var pågår. Mellan 1 till …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats av ett NSF-stipendium (DEB-1020460) att M.S.H. och USDA AFRI bidrag (2010-03752) att M.S.H. Författarna vill tacka Brennan Zehr för färgning mjöllus ägg med mycket skicklighet och Zen. Författarna vill tacka Mike Riehle för att tillåta användning av hans fluorescerande Mikroskop för avbildning. Författarna tackar Suzanne Kelly och Marco Gebiola för ägg bilder. Författarna tackar Suzanne Kelly och Jimmy Conway för att hjälpa på avgörande ögonblick under experimenten.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
References
- Charnov, E. L., May, R. M. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. , 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. . Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R. . Social Evolution in Ants. , (1995).
- Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
- Liu, S. -. S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
- Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
- Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
- Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
- Sun, D. -. B., Li, J., Liu, Y. -. Q., Crowder, D. W., Liu, S. -. S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
- Liu, S. -. S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there?. Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
- Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
- Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
- Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
- Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
- Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
- Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
- Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
- Guo, J. -. Y., Cong, L., Wan, F. -. H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
- Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
- Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
- Qin, L., Pan, L. -. L., Liu, S. -. S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).
