قياس الكورتيزول في كوالا(فيسكولارتوس سينيريوس)الفراء
Summary
نقدم بروتوكول لتحديد المذيبات استخراج الأمثل لقياس الكورتيزول من الفراء كوالا. والمذيبات المستخدمة في هذا البروتوكول هي الميثانول والإيثانول والإيزوبروبانول. تحديد المذيبات استخراج الأمثل سوف تساعد في قياس موثوق الفراء لتحديد تأثير الإجهاد المزمن على الكوالا.
Abstract
الطرق المثلى لاستخراج هرمون المستخدمة لقياس الإجهاد في الحيوانات عبر أنواع العينة ليست دائماً هي نفسها. تواجه الأنواع المريخية الشهيرة في أستراليا، الكوالا(Phascolarctos cinereus)،التعرض لفترات طويلة لعوامل الإجهاد التي يسببها الإنسان وتقييم الإجهاد المزمن في السكان البرية له ما يبرره على وجه السرعة. واحدة من أكثر الطرق فعالية لقياس الإجهاد المزمن من خلال تحليل هرمون الكورتيزول الكورتيزول الكورتيزول في الشعر أو الفراء، كما أنه يدعم الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية. تهدف هذه الدراسة التحقق من صحة المختبر لاختبار التقنيات الحالية للتحقق من طريقة استخراج هرمون الأمثل لاستخدامها كتدبير غير الغازية من الكورتيزول في الفراء كوالا. ومن المسلم به أن استخدام التقنيات غير الغازية لقياس هرمونات الإجهاد هو المفضل على التقنيات التقليدية، الغازية بسبب وجهات نظرهم العملية والأخلاقية المثالية. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأسهل نسبيا للحصول على الفراء من الكوالا مما هو عليه للحصول على عينات من دمائهم. استخدمت هذه الدراسة عينات من فرو الكوالا المكتسبة من مستشفى أديلايد كوالا والحياة البرية لتشغيل عدد من تقنيات استخراج الهرمونات في محاولة للتحقق من طريقة استخراج الكورتيزول الأمثل. وأظهرت النتائج أن الميثانول 100٪ قدم استخراج المذيبات الأمثل مقارنة مع الإيثانول 100٪ أو 100٪ isopropanol على أساس نتائج التوازي. وفي الختام، وفرت هذه الطريقة لاستخراج الكورتيزول من فرو كوالا اختباراً موثوقاً به غير الغازية يمكن استخدامه لدراسة الإجهاد المزمن في الكوالا.
Introduction
النظم الإيكولوجية الأسترالية تحافظ على حياة الإنسان من خلال توفير الخدمات بما في ذلك الغذاء والألياف من بين العديد من التفاعلات الدينامية الأخرى1. ومن المفارقات أن النشاط البشري هو الذي يعمل كمحرك مهيمن لاضطراب النظم الإيكولوجية من خلال تغيير التنوع البيولوجي2. إن تجزئة الموائل، المعروفة باسم عملية تقسيم الموائل المستمرة الكبيرة إلى بقع صغيرة من الأراضي، معزولة عن بعضها البعض، هي التغير الرئيسي في التنوع البيولوجي البشري المنشأ الذي يهدد النظم الإيكولوجية الأسترالية2. ويغير تجزؤ الموئل هيكل وتنوع تكوين الأنواع في أي منطقة معينة، مما يقلل من مساحة الموائل اللازمة لهذه الأنواع للحفاظ على تجمعات قابلة للحياة2. ونتيجة لذلك هو زيادة المنافسة بين الأنواع للموارد بما في ذلك الغذاء والوقود والألياف والمياه3. إن تدمير النظم الإيكولوجية الأسترالية من خلال تغيير التنوع البيولوجي له عواقب كارثية على العديد من الأنواع الأسترالية الأصلية1.
الأنواع المريخية الأكثر شهرة في أستراليا، والكوالا(Phascolarctos cinereus)،يعتمد على النظم الإيكولوجية الأسترالية تبقى صحية لبقائها4. وأدى إدخال التسوية الأوروبية إلى انخفاض سريع في عدد السكان الأستراليين من الكوالا، حيث ذبحوا بسبب رشقاتهم سعيا وراء الربح في تجارة تصدير ية كبيرة5. وقد حظرت هذه الممارسة في الثمانينات، ثم تمكن سكان الكوالا من تحقيق الاستقرار5. ومع ذلك، أدى النمو الأسي للسكان البشر في هذا النوع تتنافس على جزء كبير من بيئتها، وبقاءها هو مرة أخرى تحت التهديد6. ووفقا للاتحاد الدولي لحفظ الطبيعة، فإن جميع سكان الكوالا الأستراليين مدرجون في قائمة عرضة للانقراض مع انخفاض الاتجاه السكاني7. وتعزى هذه القائمة إلى عدم اليقين بشأن البارامترات السكانية ذات الصلة والتباين الملحوظ في الاتجاهات السكانية لهذا النوع7. وباعتبارها أكثر الحيوانات شهرة ومتوطنة، فإن الكوالا تعود بالفائدة إلى حد كبير على الاقتصاد الأسترالي من خلال السياحة (مكتب البيئة والتراث في نيو ساوث ويلز 2018). ويشير تقدير إلى أن السياحة ذات الصلة بالكوالا قد ولدت حوالي 9000 فرصة عمل وتسهم بما يتراوح بين 1.1 و2.5 مليار دولار في الاقتصاد (مكتب البيئة والتراث في نيو ساوث ويلز 2018). إزالة أي نوع واحد لديه القدرة على أن تكون كارثية، ويمكن أن ينظر إليها في الانخفاض المطرد للحياة البرية الأسترالية الأصلية6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاقتصاد الأسترالي سوف يشعر العواقب إذا استمر سكان الكوالا الأسترالية في الانخفاض بمعدل6.
ويُقترح أن انتشار الوفيات والأمراض استجابة لتجزؤ الموائل هو نتيجة للإجهاد المزمن8. وبالفعل، أُعلن عن انقراض أربعة وعشرين نوعاً من الأنواع المريخية في أستراليا بسبب تجزؤ الموائل، مع اتباع الكوالا اتجاهاً مماثلاً8. إن تعقيد تجزؤ الموائل والنظم البيولوجية هو أمر تآزري ولكن يمكن تفكيكه من خلال تحليل الاستجابة للإجهاد6. عموما، أي اضطراب في محيط الحيوانات الطبيعية ينشط سلسلة معقدة من الأحداث العصبيةالهرمونية، والمعروفة باسم “القتال أو الطيران” استجابة 9،10. هذه الاستجابة للإجهاد هي العملية التي تبدأ في الدماغ حيث يتم تنشيط محور الغدة النخامية الغدة النخامية الغدة الكظرية (HPA)11. عنصر من الدماغ يسمى تحت المهاد النشرات هرمون الإفراج عن الكورتيكوتروفين (CRH), الذي يشير بعد ذلك الغدة النخامية الأمامية لإطلاق هرمون أدرينوكورتيكوتروبيوم (ACTH)11. وهذا بدوره يحفز إفراز الكورتيزون من النخاع الكظري. يقوم الجسم بتعميم الكورتيزون من خلال الدم، مما يحول تخزين الجلوكوز من الجليكوجين ويعبئ الجلوكوز من الجليكوجين المخزن11. هذه السلسلة من الأحداث العصبية الهرمونية هي الاستجابة المستخدمة من قبل الحيوان للتعامل مع المحفزات لا يمكن التنبؤ بها11. ومع ذلك ، عندما يتم إطلاق الكورتيزون وتبقى مرتفعة لفترة طويلة من الزمن ، يعتبر الحيوان يعاني من الإجهاد المزمن12،13. وتنطوي هذه العملية على تحويل الطاقة بعيدا عن الوظائف الجسدية البدنية الأخرى، حيث أنها ضرورية لإنتاج الغلوكوكورتيكود المستمر13. ونتيجة لذلك، يمكن للإجهاد المزمن أن يمنع النمو والإنجاب والمناعة، وكلها سمات اللياقة البدنية الرئيسية المطلوبة للبقاء على قيد الحياة14.
قياس إنتاج الحيوان غلوكوكورتيكود هو مؤشر شائع يستخدم لتحديد ما إذا كان الحيوان يعاني من الإجهاد الفسيولوجي15. للقيام بذلك، يمكن قياس الكورتيزون في بلازما الدم، المصل، اللعاب، البول أو البراز16. ومع ذلك، تشير الأدلة إلى أن الشعر هو مؤشر أكثر فعالية بكثير من الإجهاد المزمن، بدلا من16المذكورة أعلاه . ويرجع ذلك إلى أن الشعر يعتقد أن دمج الهرمونات المنقولة بالدم خلال مرحلة نموها; هو نسبيّا ثابتة; وأي الكورتيزول المكتشف في الشعر يعكس الإجهاد الفسيولوجي الذي عانى منه خلال فترة نمو الشعر، والذي يمكن أن يكون أسابيع حتى أشهر16. وعلاوة على ذلك، فإن أي مجموعة من الكورتيزول ينبغي أن تكون غير الغازية من أجل تقليل الإجهاد المرتبط ة التقاط والتعامل مع16. ومع ذلك، فإن أي الإجهاد من ذوي الخبرة خلال هذا الحدث لن يؤثر على مستويات الكورتيزون في الشعر16. كانت هناك العديد من الدراسات التي تستكشف كفاءة استخدام الشعر لقياس الإجهاد على المدى الطويل في عدد من الحيوانات، وتشمل دراسات عن الرنة، الدببة الأشيب، الحصى ريسوس، muskoxen، والدببة البني17،18، 19 سنة , 20 , 21.عادة ما يتم استخراج الكورتيزول الشعر عن طريق غسل العينة أولا لضمان العرق والزهم المستمدة من الكورتيزول المودعة على سطح الشعر لا يتم استخراج مشترك مع الكورتيزول ومن ثم سحق العينة في حبة الخافق22. بعد الغسيل، تحتاج العينة إلى تجفيفها لضمان التبخر الكامل22. وأخيرا، باستخدام المذيبات، يمكن استخراج العينة وإعادة تشكيلها لتسهيل اختبار الكورتيزول22. المذيب الأكثر شيوعا المستخدمة لاستخراج الكورتيزول من الفراء هو الميثانول21،23؛ ومع ذلك, هناك بعض الدراسات التي تستخدم الإيثانول وisopropanol في تقنيات استخراج الكورتيزول. على سبيل المثال، كانت دراسة استخدام الإيثانول ناجحة لاستخراج الكورتيزول من السائل السلوي البشري24. بالإضافة إلى ذلك، كانت دراسة التي استخدمت isopropanol ناجحة لاستخراج الكورتيزول من شعر الإنسان والأظافر25،26. ولهذا السبب، اختبرت هذه الدراسة جميع المذيبات الثلاثة (الميثانول والإيثانول والإيزوبروبانول) لتحديد أيهما كان الأكثر نجاحا لاستخراج الكورتيزول من عينات من فرو الكوالا.
وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة استخدام التقنيات الحالية للتحقق من صحة تقنية استخراج هرمون الأمثل لاستخدامها كتدبير غير الغازية من الكورتيزول من الفراء كوالا. وقد تحقق ذلك عن طريق اختبار ثلاثة مذيبات استخراج (الميثانول، الإيثانول، وإيزوبروبانول). افترضنا أن الميثانول سيكون المذيب الأمثل المستخدم لاستخراج الكورتيزول من فرو كوالا لأنه هو المذيب الموصى به لاستخراج من قبل شجرة اختبار الكورتيزول مجموعات27.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدد من الدراسات التي تستخدم مجموعة من التقنيات للكشف عن الكورتيزول في الفراء الثدييات. تعرض هذه الدراسة نتائج للكشف عن الكورتيزول في الفراء الذي تم جمعه من كوالا البرية المعرضة للإجهاد البشري الحالي. استخدمت هذه الدراسة الرائدة الفراء لاختبار أي من المذيبات الثلاثة شائعة الاستخدام …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل البحوث الناشئة لإدوارد نارايان من خلال جامعة سيدني الغربية، كلية العلوم والصحة. ويشكر المؤلفون جاك نخول على مساعدته في معالجة العينات.
Materials
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World’s Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
