科蒂醇测量在考拉 （菲斯科拉托斯西尼鲁斯） 毛皮

Summary

我们提出了一个协议，以确定最佳提取溶剂，以测量皮质醇从考拉毛皮。该协议中使用的溶剂是甲醇、乙醇和异丙醇。确定最佳萃取溶剂将有助于可靠地测量毛皮，以确定慢性应力对考拉的影响。

Abstract

用于测量不同样本类型动物压力的激素提取的最佳方法并不总是相同的。澳大利亚标志性的猎物物种，考拉（Phascolarctoscinereus），面临长期暴露在人为引起的压力和评估长期压力在野生种群是迫切需要的。测量慢性压力的最有效方法之一是通过分析头发或毛皮中的糖皮质激素皮质醇，因为它支持生理和行为反应。该实验室验证研究旨在测试当前技术，以验证最佳激素提取方法，作为考拉毛皮中皮质醇的非侵入性测量。人们认识到，使用非侵入性技术测量压力激素是首选，而不是传统的侵入性技术，由于其理想的实用和道德立场。此外，从考拉获得毛皮比获取考拉血液样本要容易得多。这项研究使用从阿德莱德考拉和野生动物医院获得的考拉毛皮样本，运行一些激素提取技术，试图验证最佳皮质醇提取方法。结果表明，100%甲醇提供的最佳溶剂萃取，而100%乙醇或100%异丙醇基于平行结果。总之，这种从考拉毛皮中提取皮质醇的方法提供了一种可靠的非侵入性检测，可用于研究考拉的慢性压力。

Introduction

澳大利亚的生态系统通过提供包括食物和纤维在内的许多其他动态相互作用的服务来维持人类生命1。具有讽刺意味的是，人类活动是生态系统通过生物多样性变化破坏的主要^驱动力。生境破碎，即将大型连续生境分割成小块土地的过程，彼此隔绝，是威胁澳大利亚生态系统的主要人为生物多样性变化2。生境破碎改变了任何特定地区物种构成的结构和多样性，从而减少了这些物种维持生存种群所需的栖息地面积2。其结果是物种之间对食物、燃料、纤维和水等资源的竞争^加剧。生物多样性变化对澳大利亚生态系统的破坏正在对许多澳大利亚本土^物种1造成灾难性后果。

澳大利亚最具代表性的猎物物种，考拉（Phascolarctoscinereus），取决于澳大利亚的生态系统保持健康，以生存4。欧洲定居的引入导致澳大利亚考拉的数量迅速减少，因为考拉在大型^{出口贸易中}为了追求利润而被宰杀。这种做法在20世纪80年代被禁止，考拉的数量随后得以^稳定。然而，人类的指数级增长导致这个物种争夺大部分栖息地，它们的生存再次^{受到威胁。}根据国际自然保护联盟（IUCN）的数据，澳大利亚考拉的所有种群都被列为易灭绝种群，种群数量^{呈下降趋势。}这个清单归因于相关种群参数的不确定性和该^物种7种群趋势的明显变化。作为最具代表性和地方性的动物，考拉主要通过旅游业为澳大利亚经济带来益处（新南威尔士州环境与遗产办公室，2018年）。据估计，与考拉有关的旅游业创造了约9，000个就业机会，为经济贡献了11亿至25亿美元（新南威尔士州环境与遗产办公室，2018年）。任何一个物种的灭绝都有可能是灾难性的，这可以从澳大利亚本土野生动物^的稳步减少中看。此外，如果澳大利亚考拉的数量继续以6.的速度下降，澳大利亚经济将感受到影响。

有人认为，由于栖息地破碎，死亡和疾病的流行是慢性^压力8的结果。在澳大利亚，已有24种猎物因栖息地破碎而宣布灭绝，其中考拉也呈类似^趋势。生境破碎和生物系统的复杂性是协同的，但可以通过分析应力^响应6来解压缩。一般来说，动物自然环境中的任何干扰都会激活一系列复杂的神经激素事件，称为”战斗或逃跑”反应9，10。这种对压力的反应是一个过程，开始在大脑中下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴被^激活11。大脑中一种叫做下丘脑的成分释放皮质素释放激素（CRH），然后发出信号前脑垂体释放腺皮质激素（ACTH）11。这反过来又刺激从肾上腺髓质分泌物。身体通过血液循环糖皮质激素，这转移了糖原的葡萄糖储存，并从储存的糖^原11中调动葡萄糖。这种神经激素事件级联是动物用来处理不可预测的刺激11的反应。然而，当糖皮质激素被释放，并保持长期升高，动物被认为是经历慢性压力12，13。这个过程涉及转移能量从其他身体机能，因为它是需要正在进行的糖皮质激素^生产13。因此，慢性压力会阻碍生长、繁殖和免疫，所有这些都^{是生存所需的}关键健身特征。

测量动物的糖皮质激素生产是一个常见的指标，用来确定动物是否正在经历生理^压力15。为此，糖皮质激素可以在血浆、血清、唾液、尿液或粪便^{中测量16。}然而，有证据表明，与^上述16相反，头发是慢性压力的更有效指标。这是因为头发被认为在生长阶段含有血液传播的激素;相对稳定;在头发中检测到的任何皮质醇都会反映头发生长期间经历的生理压力，这种压力可能是数周^到16个月。此外，任何皮质醇的集合应该是非侵入性的，以尽量减少与捕获^和处理16相关的压力。然而，在这次事件期间经历的任何压力不会影响^头发16的糖皮质激素水平。有许多研究探索使用头发测量一些动物的长期压力的能力，包括研究驯鹿，灰熊，河河猴，木牛和棕熊17，18，^19,20,21.头发皮质醇通常通过先洗样品来提取，以确保沉积在头发表面的汗液和皮脂衍生皮质醇不与皮质醇共同提取，然后用珠状^物22粉碎样品。洗涤后，样品需要干燥，以确保完全^蒸发22。最后，使用溶剂，可以提取和重组样品，以利于皮质^醇22的测定。用于从毛皮中提取皮质醇的最常见溶剂是甲醇21，23;然而，有一些研究使用乙醇和异丙醇在他们的皮质醇提取技术。例如，一项使用乙醇的研究成功地从人类羊水中提取皮质^醇24。此外，一项使用异丙醇的研究成功地从人类头发和指甲中提取皮质醇25，26。因此，本研究测试了所有三种溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇），以确定哪种溶剂是从考拉毛皮样本中提取皮质醇最成功的。

本研究的主要目的是使用当前技术来验证最佳激素提取技术，作为考拉毛皮皮质醇的非侵入性测量。这是通过测试三种萃取溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇）实现的。我们假设甲醇将是从考拉毛皮中提取皮质醇的最佳溶剂，因为它是Arbor测定皮质醇试剂^盒27推荐的萃取溶剂。

Protocol

这个项目是在严格的动物和人类护理准则下进行的。动物伦理由西悉尼大学（A12373）授予。此外，西悉尼大学提交并接受了实验室风险评估和生物安全和辐射表格，以安全地开展此项研究 （B12366）。 注：该项目的考拉毛皮样本来自阿德莱德考拉和野生动物医院，位于南澳大利亚普林普顿安扎克公路282号。毛皮是从一只考拉那里取出的，由于伤势严重，它被送进了医院并安乐?…

Representative Results

使用平行性测定感兴趣的激素代谢物的检测。使用平行曲线，50% 结合点还确定标准曲线上的样品稀释系数（图 1）。如平行图（图1所示），100%乙醇和100%异丙醇提取物没有提供与皮质醇标准的平行位移。然而，100%甲醇提取物提供与皮质醇标准的平行位移。干提取物在测定缓冲液（100%乙醇100μL和400μL测定缓冲液）中通过稀释进行整齐地运行。 内（内?…

Discussion

有许多研究使用一系列技术来检测哺乳动物毛皮中的皮质醇。这项研究提供了检测皮质醇在毛皮收集的结果，从野生考拉暴露于当前人为应力。这项开创性的研究使用毛皮来测试三种常用溶剂中哪一种最适合从考拉毛皮中提取皮质醇（一种慢性压力的测量指标）。结果表明，100%甲醇是此类哺乳动物毛皮中皮质醇提取的推荐溶剂。

乙醇、甲醇和异丙醇都是氢分子结合的原发性?…

Materials

Centrifuge Tubes	n/a	n/a	1.5 mL
Chrome Steel Beads	n/a	n/a	3.2 mm x 3
Cortisol Kit	Arbor Assays	K003-H1W	Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	Arbor Assays	K003-H5	Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Isopropanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Methanol	n/a	n/a	HPLC Grade
Micro Pipette	n/a	n/a	n/a
Micro Precision Sieve	n/a	n/a	0.5 mm
Microplate Reader	Bio Radi	n/a	n/a
Microplate Washer	Bio Radi	n/a	n/a
Orbital Shaker	Bio Line	n/a	n/a
Plastic Weighing Boat	n/a	n/a	n/a
Plate Sealer	n/a	n/a	n/a
Precision Balance	n/a	n/a	n/a
Vortex Mixer	Eppendorf	n/a	n/a