Collection de souffle auprès des enfants pour la découverte de biomarqueurs de la maladie
Summary
Ce protocole décrit une méthode simple pour l’acquisition d’échantillons d’haleine auprès des enfants. Brièvement, des échantillons d’air mélangé se concentrent avant dans tubes absorbants avant l’analyse de la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Biomarqueurs de souffle des maladies infectieuses et non infectieuses peuvent être identifiés à l’aide de cette méthode de collecte de souffle.
Abstract
Analyse et air expiré peuvent être utilisés pour découvrir des biomarqueurs volatiles dans un certain nombre de maladies infectieuses et non infectieuses, comme le paludisme, la tuberculose, le cancer du poumon et une maladie du foie. Ce protocole décrit une méthode reproductible d’échantillonnage souffle chez les enfants et ensuite stabiliser les échantillons d’haleine pour analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS). L’objectif de cette méthode est d’établir un protocole standardisé pour l’acquisition d’échantillons d’haleine pour analyse chimique, auprès d’enfants âgés de 4 à 15 ans. Tout d’abord, le souffle est échantillonné à l’aide d’un embout en carton attaché à une vanne 2 voies, qui est reliée à un sac de 3 L. Haleine analytes sont ensuite transférées dans un tube de désorption thermique et stockés à 4-5 ° C jusqu’à l’analyse. Cette technique a servi antérieurement pour capturer le souffle des enfants atteints de paludisme pour l’identification de biomarqueurs souffle réussie. Par la suite, nous avons appliqué avec succès cette technique aux cohortes pédiatriques supplémentaires. L’avantage de cette méthode est qu’il exige une coopération minimale de la part du patient (d’une valeur particulière dans les populations pédiatriques), dispose d’un délai court collection, ne nécessite pas de personnel formé et peut être effectuée avec des appareils portatifs en paramètres de champ de ressources limitées.
Introduction
Biomarqueurs peuvent donner des informations précieuses sur des processus biologiques normaux et pathologiques qui peuvent contribuer à la maladie cliniquement identifiable. Récemment, on constate un intérêt croissant dans l’évaluation des substances volatiles souffle comme biomarqueurs pour une variété d’états pathologiques, y compris l’infection, troubles métaboliques et cancer 1. Air expiré contient des niveaux quantifiables de composés organiques volatils (COV), les composés organiques semi-volatils et matériel microbienne dérivée (p. ex., les acides nucléiques des bactéries et des virus). L’objectif central de l’analyse de l’air expiré est de mieux comprendre l’état d’une condition médicale et/ou expositions environnementales non invasive. Il existe diverses méthodes pour recueillir et d’analyser l’air expiré, selon les constituants d’intérêt. Il n’existe actuellement aucune méthode de collecte normalisés air expiré, qui complique l’analyse comparative des résultats entre les études. Normalisation des procédures de collecte de souffle est essentiel, car la procédure d’échantillonnage lui-même a un effet considérable sur les résultats en aval des analyses d’haleine.
Dans de nombreuses études, l’échantillonnage souffle respiratoire tardive est travailleur2,3. Ce prélèvement consiste à jeter la portion initiale de l’air expiré (« dead space »), afin de capter préférentiellement l’air à la fin du cycle de respiration. L’avantage de cette stratégie est qu’il minimise les concentrations de COV exogène (p. ex., les COV environnementales), tout en enrichissant pour les COV endogène, spécifique au patient. Cette méthode exclut les premières secondes de l’expiration d’un individu avant de prélever l’échantillon d’haleine. Autres chercheurs ont utilisé un capteur de pression pour activer l’échantillonnage durant une phase prédéfinie d’expiration4,5. Capteurs de pression nécessitant une ingénierie complexe, cette méthode alternative nécessite un dispositif de prélèvement dédié et relativement coûteux.
L’échantillonnage souffle pédiatrique peut être particulièrement difficile. Des principales préoccupations est que les jeunes enfants peuvent être incapables de coopérer avec les protocoles d’expiration volontaire d’air « dead space ». Pour cette raison, il est plus facile à obtenir mixte souffle respiratoire des enfants. Toutefois, un bémol majeur avec les échantillons d’haleine respiratoire mixte est le risque de contamination environnementale et matériel. Par conséquent, la faisabilité de la collecte pédiatrique est une préoccupation conduite dans le domaine.
En outre, pour les méthodes de collecte, stockage des échantillons d’haleine peut également influencer qualité d’échantillon. La forte humidité en haleine exhalate et les concentrations ultra-faibles (parties par billion) de volatils organiques composés font souffle échantillons d’haleine particulièrement sensibles aux problèmes liés au stockage6,7. Malgré son grand potentiel des techniques en temps réel comme proton transfert réaction-spectrométrie de masse (PTR-MS), GC-MS demeure l’étalon-or pour l’analyse des échantillons d’haleine. Étant donné que l’analyse des échantillons d’haleine GC-MS est une technique en mode hors connexion, il est couplé avec des méthodes de préconcentration comme tubes de désorption thermique (TD), micro-extraction en phase solide et dispositifs de piège d’aiguille. Avant la préconcentration, échantillons d’haleine doivent être stockés temporairement en polymère sacs8. Sacs de polymère sont populaires en raison de leur prix modéré, relativement bonne longévité et réutilisabilité. Alors que les sacs peuvent être réutilisés, temps et les efforts doivent s’assurer efficace nettoyage7,8. Chaque type de sac spécifique nécessite aussi empiriquement déterminées et standardisées des procédures pour le contrôle de la qualité, la réutilisation et la récupération.
TD tubes sont employés couramment pour la préconcentration souffle parce qu’ils capturent un grand nombre de substances volatiles et peuvent être personnalisés. Les matériaux absorbants utilisés pour l’emballage des tubes TD peuvent être adaptés à des applications particulières et volatiles de cible particulière d’intérêt. TD tubes considérablement améliorer le confort des études de biomarqueurs de souffle, en particulier sur les sites distants, parce que TD tubes en toute sécurité stocker des substances volatiles souffle pendant au moins deux semaines et sont faciles à transport3.
Dans un effort pour standardiser l’air expiré pédiatrique pour découverte de biomarqueurs, nous décrivons ici une méthode simple pour collecter les souffle de jeunes enfants. Pour illustrer les résultats représentatifs des protocoles mis en œuvre, les données dépersonnalisées sont présentées dans une cohorte en cours des enfants (8-17 ans) en cours d’évaluation pour la maladie de boissons acides gras du foie (stéatose hépatique non alcoolique). Résultats complets et analyse de cette étude seront communiqués dans une publication ultérieure. Dans cet ouvrage, les auteurs rapportent un sous-ensemble des données pour démontrer l’application de notre protocole. En bref, les enfants sont chargés d’expirer normalement par embout buccal dans un sac de polymère, comme si « souffle un ballon. » Le processus est répété 2 – 4 fois jusqu’à 1 L de la respiration sont recueilli. L’échantillon est ensuite transférée dans un tube de TD et stocké à 5 ° C avant l’analyse par CPG-SM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré des progrès considérables dans la recherche de souffle durant la dernière décennie, des pratiques normalisées pour l’échantillonnage et l’analyse des composés volatils de gaz souffle restent indéfini10. Des principales raisons de cette absence de normalisation a été la diversité des méthodes de collecte de souffle, ayant un impact direct sur la diversité chimique qui en résulte présente dans n’importe quel échantillon d’air expiré donnée. Respiration exhalate cont…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous exprimons notre gratitude aux enfants et aux familles de l’hôpital St Louis pour l’enfance qui ont participé à cette étude. Nous reconnaissons les efforts uniques de Mme Stacy Postma et Mme Janet Sokolich lors de la collecte de souffle. Ce travail est soutenu par la fondation de l’hôpital des enfants St. Louis.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
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