Coleção de respiração das crianças para a descoberta de biomarcador de doença
Summary
Este protocolo descreve um método simples para a aquisição das amostras de respiração dos filhos. Brevemente, amostras de ar misto pré-concentram-se em tubos de adsorvente antes da análise por cromatografia gasosa / espectrometria de massa. Biomarcadores de respiração de doenças infecciosas e não-infecciosa podem ser identificados usando este método de coleta de respiração.
Abstract
Análise e coleta de respiração podem ser usados para descobrir biomarcadores voláteis em um número de doenças infecciosas e não infecciosas, como malária, tuberculose, câncer de pulmão e doença hepática. Este protocolo descreve um método reprodutível para amostragem de respiração em crianças e depois estabilizar amostras de respiração para uma análise mais aprofundada com cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS). O objetivo desse método é estabelecer um protocolo padronizado para a aquisição de amostras de hálito para posterior análise química, de crianças com idades entre 4 a 15 anos. Primeiro, respiração é amostrada utilizando um papelão bocal conectado a uma válvula de 2 vias, que é conectada a uma bolsa de 3 L. Respiração analitos são então transferidos para um tubo de desorção térmica e armazenados a 4-5 ° C até análise. Esta técnica tem sido usada anteriormente para capturar o fôlego das crianças com malária para identificação de biomarcador de respiração bem sucedida. Posteriormente, nós tem aplicado com sucesso esta técnica de coortes pediátricas adicionais. A vantagem deste método é que ele exige cooperação mínima por parte do paciente (de determinado valor em populações pediátricas), tem um período curto da coleção, não requer pessoal treinado e pode ser realizado com equipamento portátil em configurações de campo de recursos limitados.
Introduction
Biomarcadores podem render informações valiosas sobre os processos biológicos normais e patológicos que podem contribuir para a doença clinicamente identificável. Recentemente, tem havido um interesse crescente na avaliação de compostos voláteis de respiração como biomarcadores para uma variedade de doenças, incluindo câncer 1, distúrbios metabólicos e infecção. Ar exalado contém níveis quantificáveis de compostos orgânicos voláteis (COV), compostos orgânicos semivoláteis e amostras com derivada material (por exemplo, os ácidos nucleicos de bactérias e vírus). O objetivo central de análise do ar exalado é obter conhecimento sobre o status de uma condição médica e/ou exposições ambientais não invasiva. Existem vários métodos de coleta e análise de ar exalado, dependendo dos componentes de interesse. Atualmente não há nenhum método de coleta de ar exalado padronizada, que dificulta a análise comparativa dos resultados através de estudos. Padronização de procedimentos de coleta de respiração é essencial, como o próprio procedimento de amostragem tem um efeito considerável sobre os resultados a jusante das análises de respiração.
Em muitos estudos, tarde amostragem respiratória respiração é empregada2,3. Esta amostragem envolve rejeitando a porção inicial do ar exalado (“dead space”), a fim de capturar preferencialmente o ar no final do ciclo de respiração. A vantagem desta estratégia é que minimiza os níveis de COV exógeno (por exemplo, VOCs ambientais), enquanto enriquece para VOCs endógenas, específicos do paciente. Este método exclui os primeiros segundos da expiração de um indivíduo antes de coletar a amostra de respiração. Outros pesquisadores têm utilizado um sensor de pressão para ativar a amostragem durante uma fase predefinida de expiração4,5. Sensores de pressão requer engenharia complexa, este método alternativo requer um dispositivo de amostragem relativamente caro e dedicado.
Amostragem de respiração pediátrica pode ser especialmente desafiador. Uma preocupação-chave é que as crianças podem ser incapazes de cooperar com protocolos para voluntária exalação de ar de “dead space”. Por esta razão, é mais fácil obter a respiração respiratória mista de crianças. No entanto, uma ressalva importante com amostras de respiração respiratória mista é o risco de contaminação ambiental e material. Portanto, a viabilidade de coleta pediátrica é uma preocupação de condução no campo.
Além disso, métodos de coleta, armazenamento de amostras de hálito também pode influenciar a qualidade da amostra. A alta umidade no ar exhalate e as ultra baixas concentrações (partes por trilhão) de respiração orgânicos voláteis compostos fazer respiração amostras particularmente suscetível a problemas relacionados a armazenamento6,7. Apesar do grande potencial das técnicas em tempo real como espectrometria de massa-reação de transferência de próton (PTR-MS), GC-MS continua a ser o padrão-ouro para a análise de amostras de respiração. Desde que a análise por CG-em de amostras de respiração é uma técnica de off-line, está acoplada com métodos de pré-concentração tais como tubos de desorção térmica (TD), microextração de fase sólida e dispositivos de armadilha de agulha. Antes da pré-concentração, amostras de hálito precisam ser armazenados temporariamente em polímero sacos8. Sacos de polímero são populares por causa de seu preço moderado, relativamente boa durabilidade e capacidade de reutilização. Enquanto sacos podem ser reutilizados, tempo e esforço são necessários para garantir a eficiente limpeza7,8. Cada tipo de saco específico também requer procedimentos empiricamente determinados e padronizados para controle de qualidade, reutilização e recuperação.
Tubos de TD são amplamente utilizados para pré-concentração de respiração porque eles capturar um grande número de compostos voláteis e podem ser personalizados. Os materiais absorventes usados para embalar os tubos TD podem ser adaptados para aplicações particulares e voláteis de destino específico de interesse. Tubos de TD substancialmente melhorar a conveniência de estudos de biomarcador de respiração, especialmente em locais de campo remoto, porque TD tubos com segurança loja voláteis de respiração pelo menos duas semanas e são fáceis de transporte3.
Em um esforço para padronizar a coleção de respiração pediátrica para descoberta de biomarker, aqui nós descrevemos um método simples para coletar o hálito de crianças pequenas. Para ilustrar os resultados representativos dos protocolos implementados, dados de identificados são apresentados de uma coorte em curso das crianças (8-17 anos) submetidos à avaliação para doença hepática não-alcoólica de ácido graxo (NAFLD). Os resultados completos e a análise deste estudo serão relatados em uma publicação posterior. Neste trabalho, relatamos um subconjunto de dados que demonstrem a aplicação do nosso protocolo. Em breve, as crianças são instruídas a Expire normalmente através do bocal em um saco de polímero, como se “soprando um balão.” O processo é repetido 2 – 4 vezes até 1 L de ar é coletada. A amostra é então transferida para um tubo de TD e armazenada a 5 ° C, antes da análise por GC-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar dos progressos consideráveis em pesquisa de fôlego na última década, práticas padronizadas para a amostragem e análise de compostos voláteis de gás de respiração permanecem indefinidos10. A principal razão para essa falta de padronização tem sido a diversidade de métodos de recolha de respiração, que têm impacto direto sobre a diversidade química resultante presente em qualquer amostra de determinado ar exalado. Respiração exhalate contém uma extensa gama de compostos o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expressamos a nossa gratidão para as crianças e famílias de St. Louis Hospital das crianças que participaram neste estudo. Reconhecemos os esforços exclusivos da Sra. Stacy Postma e Sra. Janet Sokolich durante a coleta de respiração. Este trabalho é apoiado pela Fundação de Hospital de crianças St. Louis.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
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