Un modèle d’Interface humaine hémato-encéphalique pour étudier les passages barrière de pathogènes ou de médicaments et de leurs Interactions avec le cerveau

Summary

Nous présentons ici un protocole décrivant la mise d’un cellulo en BBB (hémato-encéphalique)-culture polyester membrane poreuse Minibrain insérer le système afin d’évaluer le transport des biomolécules ou des agents infectieux à travers un BBB humain et leur impact physiologique sur les neurones voisins.

Abstract

Le précoce dépistage de médicaments du système nerveux sur un pertinent et fiable en modèle BBB cellulo pour leur pénétration et leur interaction avec la barrière et le parenchyme du cerveau est encore un besoin non comblé. Pour combler cette lacune, nous avons conçu un 2D dans modèle de cellulo, le BBB-Minibrain, en combinant un polyester membrane poreuse culture insert BBB modèle humain avec un Minibrain formé par une tri-culture de cellules du cerveau humain (les neurones, les astrocytes et les cellules microgliales). Le BBB-Minibrain nous a permis de tester le transport d’un candidat-médicament neuroprotecteur (p. ex., Neurovita), à travers la BHE, afin de déterminer le ciblage spécifique de cette molécule aux neurones et de montrer que la propriété neuroprotectrice de la drogue a été préservée après la drogue avait traversé la BHE. Nous avons également démontré que le BBB-Minibrain constitue un modèle intéressant pour détecter le passage de particules virales à travers la barrière des cellules endothéliales et surveiller l’infection de la Minibrain de particules virales neuro-invasive. Le BBB-Minibrain est un système fiable, facile à manipuler pour les chercheurs formés dans les techniques de culture de cellules et prédictive des phénotypes des cellules cérébrales après traitement ou une insulte. L’intérêt de tels tests cellulo serait double : introduction atténuant les étapes tôt dans le développement de médicaments d’une part et la réduction de l’utilisation d’autre part l’expérimentation animale.

Introduction

Le cerveau est séparé de la circulation systémique par une structure non perméable qui limite les échanges entre le parenchyme du cerveau et le sang, appelée la barrière sang – encéphalique (BHE). Composée principalement de cellules endothéliales cérébrales, la BHE dynamiquement interagit avec les astrocytes, la microglie périvasculaires et neurones du parenchyme cérébrales voisines. Les trois grandes fonctions de la BHE sont la création et le maintien de l’homéostasie ionique pour les fonctions neuronales, alimentation du cerveau avec les éléments nutritifs et protection contre les lésions toxiques ou l’entrée d’agents pathogènes^1,2, qui contribuent à le maintien de l’homéostasie du cerveau et ses fonctions³. Cette barrière est tellement efficace que seulement peu de médicaments peut croiser le BBB^4,5. À l’heure actuelle, les méthodes disponibles pour prédire si une molécule passerez la BHE et diffuse dans le cerveau se composent d’ex vivo études sur le suivi d’image matérielle, autopsie du cerveau de volontaires humains par IRM (imagerie par résonance magnétique) ou PET (positon emission tomographie par ordinateur) ou pharmacodynamique et pharmacocinétiques études précliniques dans animaux^6,7,8. Ces techniques et les modèles ont des limites, telles que la résolution limitée du PET et la faible sensibilité de MRI^6,8, la difficulté de quantifier les molécules (c’est-à-dire, les molécules d’anticorps basé par exemple) que mal pénétrer le cerveau⁷et pour la préclinique étudie leur coût élevé et la station balnéaire de l’expérimentation animale.

Le dernier point est important parce que, selon des 3R règles, (remplacement, réduction et raffinement d’une expérimentation animale), les administrations réglementaires ont demandé que les chercheurs développent toute urgence alternative scientifiquement exacte à l’animal expérimentation^{9,10,11,12,13,14,15}.

Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles in vitro de BHE ont été proposées^16,17,18 en cultivant sur filtre à membrane insère des cellules endothéliales de différentes espèces comme la souris, rat, bovines et porcines. Dans l’espèce humaine est, la disponibilité rare et difficile des cellules primaires a incité les chercheurs à développer des modèles humains, basés sur les cellules endothéliales immortalisées cerveau ou de cellules souches humaines issues de^{19,20, 21}. Ces obstacles sont bon substituts in vitro de BHE à condition qu’ils expriment des marqueurs de cellules endothéliales, marqueurs de jonction serrée, transporteurs d’efflux, solutés transporteurs, récepteurs et répondre aux stimuli endothéliales ²⁰. Quelques modèles BBB à l’aide d’inserts de membrane filtre recouvertes de cellules endothéliales et autres types de cellules (astrocytes, neurones ou péricytes^22,23,24) ont été dosés. L’objectif de ces cultures co devait augmenter les caractéristiques physiques de BBB en profitant de la sécrétion de facteurs solubles par les astrocytes/neurones ou des péricytes.

Néanmoins, aucun de ces modèles inclut le parenchyme du cerveau pour étudier et prévoir le destin d’un candidat-médicament une fois qu’il a passé la barrière. Par conséquent, notre objectif était de construire un cellulo en interface hémato-encéphalique, le BBB-Minibrain, en combinant un modèle BBB et une culture de cellules cérébrales mixte dans un seul kit. Le BBB-Minibrain utilise un système de culture consistant en un filtre poreux inséré dans un puits d’une plaque de culture cellulaire multipuits. Le filtre est recouvert de cellules hCMEC/D3, une lignée de cellules endothéliales de cerveau humain qui a fait ses preuves très fiable BBB dépistage des drogues^25,26,27, pour former la BHE. Le Minibrain, qui est une culture de coopération différenciée des neurones humains et astrocytes dérivés de la NTera/Cl2.D1 cellulaire ligne^28,29 mélangés avec la lignée de cellules microgliales humaines CHME/Cl5³⁰ au ratio correspondant à la la microglie vs ratios de neurone-astrocytes du cerveau³¹, est cultivé dans la partie inférieure de la plaque bien.

Outre l’étude de passage de la drogue à travers la BHE et leur devenir dans le parenchyme, l’interface hémato-encéphalique dans cellulo modèle pourrait être un outil puissant pour traiter l’entrée d’agents pathogènes dans le cerveau (neuroinvasiveness), la dispersion dans le cerveau (neurotropisme) et la toxicité (neurovirulence) ils peuvent exercer sur les cellules de parenchyme de cerveau. Les études de Neurovirulence et neuroinvasiveness auraient bénéficier le développement d’un système efficace en cellulo modèle et est souvent préférable de remplacer les modèles animaux. À l’aide de la trousse de BBB-Minibrain³², nous avons démontré le phénotype neuro de rares mutants viraux accumulées dans la souche de virus neurotrope Français du Virus de la fièvre jaune (c.-à-d., FNV-VFJ^33,34) utilisée pour préparer un arrêtée vaccin VFJ vivant et le passage d’une biomolécule neuroprotectrices et neuroregenerative appelé Neurovita (appelée NV dorénavant dans le manuscrit)³⁵. Parce que NV ni naturellement traverse la membrane cellulaire, ni le BBB, NV a été fusionnée avec la partie variable (HHV) d’un anticorps de la seule chaîne de lamas qui traverse les membranes biologiques, y compris la BHE et fonctionne comme une cellule pénétrant la molécule (CPM)³⁶. La propriété CPM de VHH semble dépendre le point isoélectrique et la longueur de la VHH³⁷.

Ceci en cellulo test devrait permettre de trier les molécules qui pourraient potentiellement traverser la BHE avant exécution de pharmacocinétique et de l’analyse pharmacodynamique chez les animaux et, idéalement, dans le même temps d’être en mesure de prédire leur comportement dans le système nerveux parenchyme. Ce système est biologiquement pertinente et facile à installer et à gérer par des professionnels bien formés dans la cellule culture^26,29,30,38. L’intérêt de tels tests cellulo serait double : réduire les coûts des essais précliniques d’une part et réduire l’utilisation de l’expérimentation animale en revanche.

Protocol

1. travaux de culture de Ntera/CL2 de cellules. D1 à préparer une co-culture de hNeurons post-mitotiques et hAstrocytes (NT2-n/a) NOTE : Ceci est la composante de la Minibrain (Figure 1). Cultivant la Ntera/Cl2.D1 Retirer un flacon de cellules congelées réservoir d’azote liquide. Rester sur la glace. Décongeler les cellules rapidement dans un bain-marie à 37 ° C. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL conte…

Representative Results

Le BBB-Minibrain est un cellulo in experimental modèle d’interface hémato-encéphalique. Le BBB-Minibrain est configuré sur le système d’insertion de culture membrane polyester pour imiter un sang au niveau supérieur et un habitacle de cerveau au niveau inférieur de l’interface sang-cerveau (Figure 2 aB). Il se compose d’un compartiment luminal avec le…

Discussion

Dans cet article nous montre comment construire un cellulo en interface hémato-encéphalique, le BBB-Minibrain, en combinant un modèle BBB et une culture de mélangé cerveau cellules cérébrales (Minibrain) dans un seul kit. Ce système est biologiquement pertinente, facile à installer et à gérer pour les expérimentateurs bien formés en culture cellulaire.

Comme pour tout autre modèle in vitro de BHE, on obtiendrait des résultats fiables si drastique contrôle de l’étanchéité d…

Materials

12 well plates	Corning	3336
5-fluoro-2’deoxyuridine	Merck-Sigma Aldrich	F0503
85mm Petri Dish	Sarstedt	83-3902-500
Anti-Nf200	Merck-Sigma Aldrich	N4142
β-mercapto-ethanol	Merck-Sigma Aldrich	M3148
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	On request to Dr Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside	Merck-Sigma Aldrich	C1768
Dark 96 well plates	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004	endothelial cell medium
Ethanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04
Formaldehyde	Merck-Sigma Aldrich	252549
GIEMSA	RAL Diagnostic	320310
Goat-Anti Mouse	Jackson Immuno Research	115-545-003
Goat-Anti Rabbit	Thermofisher Scientific	R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Scientific	15630-070
Hoescht 33342	Merck-Sigma Aldrich	33263
Laminine	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutamin	Thermofisher Scientific	25030-024
Lucifer Yellow	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714
PBS without Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14040-091
Pen/Strep	Eurobio	CXXPES00-07
Poly-d-Lysine	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Prolong Gold	Thermofisher Scientific	P36930
Qiashredder	QIAGEN	79656
Rat Collagen I	Cultrex	3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans	Merck-Sigma Aldrich	R2625
RNA purification kit	QIAGEN	74104
SDS	Merck-Sigma Aldrich	L4509
Sodium bicarbonate 5.6%	Eurobio	CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate	Thermofisher Scientific	11360
T75 Cell+ Flask	Sarstedt	83-1813-302	Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell	Corning	3460	polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	T3924
Ultra Pure Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Uridine	Merck-Sigma Aldrich	U3750
Versene	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Vaccine vial