تقييم وتوصيف الأوعية الهيالويدية في الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول في كل من طرق الجسم الحي والجسم الحي السابق لتصور وتوصيف الأوعية الهيالويدة بشكل كامل، وهو نموذج لانحدار الأوعية الدموية في عيون الماوس، وذلك باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري وتصوير الأوعية الفلورية فوندو للتصوير الحي والجسم الحي السابق العزلة وجبل شقة لاحقة من hyaloid للتحليل الكمي.
Abstract
في العين ، تغذي الأوعية الهيلويدالجنينية العدسة النامية وشبكية العين وتتراجع عندما تتطور الأوعية الشبكية. يمكن رؤية الانحدار المستمر أو الفاشل للأوعية الهيالويدة في أمراض مثل ارتفاع ضغط الدم المستمر الزجاجي الأولي (PHPV)، مما يؤدي إلى إعاقة مسار الضوء وضعف الوظيفة البصرية. قد يؤدي فهم الآليات الكامنة وراء انحدار الأوعية الهيالويدية إلى رؤى جزيئية جديدة في عملية الانحدار الوعائي وطرق جديدة محتملة لإدارة الأمراض مع الأوعية الهيالويدة المستمرة. هنا نقوم بوصف إجراءات تصوير الهيالويد في الفئران الحية مع التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) وتصوير الأوعية الفلورية فوندو (FFA) وبروتوكول تقني مفصل لعزل ومسطحة تصاعد الهيالويد من الجسم الحي للتحليل الكمي. تم استخدام البروتين المتصل بمستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة 5 (LRP5) كنموذج تجريبي للأوعية الهيالويدة المستمرة، لتوضيح التقنيات. وقد تيسر هذه التقنيات معاً إجراء تقييم شامل للأوعية الهيالويدية كنموذج تجريبي لانحدار الأوعية الدموية ودراسات عن آلية الأوعية الهيالويدية المستمرة.
Introduction
إمدادات الدم في العين أمر ضروري لضمان التطور الطبيعي للشبكية والأنسجة العينية المحيطة بها وتجهيز وظيفة بصرية مناسبة. هناك ثلاثة أسرة الأوعية الدموية في العين: الأوعية الدموية الشبكية، والمشيمي، وشبكة الدورة الدموية الجنينية عابرة من الأوعية الهيالويد. يتطلب تطور الأوعية الدموية العينية التنسيق المكاني والزمني في جميع أنحاء تكوين الأجنة ونضج الأنسجة. ومن بين الأسرّة الثلاثة للأوعية الدموية، فإن الأوعية الدموية هي أول نظام وظيفي لإمداد الدم يوفر التغذية والأكسجين للعدسة الجنينية المشكلة حديثاً والشبكية النامية. الأوعية الهيالويد تتراجع في نفس الوقت الذي تتطور فيه الأوعية الدموية الشبكية وتنضج1. تراجع الأوعية الدموية هيالويد أمر محوري للسماح بمسار بصري واضح لتطوير وظيفة بصرية. وبالتالي، فإن عملية الانحدار الوعائي هذه لا تقل أهمية عن نمو الأوعية الدموية الشبكية. قد يؤدي ضعف انحدار الهيالويد إلى أمراض العين. وعلاوة على ذلك، فإن تراجع الأوعية الهيالويديوفر نظاما نموذجيا للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي ينطوي عليها تنظيم انحدار الأوعية الدموية، والتي قد تكون لها آثار على تنظيم الأوعية الدموية في الأجهزة الأخرى أيضا.
يتكون الأوعية الدموية الهيالويدية، المشتقة من الشريان الهيالويد (HA)، من بروبريا الهيالوبيدة (VHP)، وستراتا فاسكولوسا لينتيس (TVL)، والغشاء الشعيراتي (PM). ويوفر التغذية للشبكية النامية، والجسم الزجاجي الأولية، والعدسة أثناء النمو الجنيني2. الناشئة عن HA، فروع VHP الأمامية من خلال زجاجي إلى العدسة. وTVL أكواب السطح الخلفي لكبسولة العدسة، وanastomoses إلى رئيس الوزراء، الذي يربط إلى الشرايين الهدبية الأمامية، وتغطي السطح الأمامي للعدسة2،3، مما أدى إلى تشكيل شبكة من الأوعية في PM 3 , 4 , 5.ومن المثير للاهتمام، لا توجد أوردة في الأوعية الدموية hyaloid، والنظام يستخدم الأوردة المشيمية لإنجاز الصرف الوريدي.
في الجنين البشري ، فإن الأوعية الدموية الهيالويدية تكاد تكتمل في الأسبوع التاسع تقريبا من الحمل وتبدأ في التراجع عندما تظهر أوعية الشبكية الأولى ، خلال الشهر الرابع من الحمل2. بدءا من ضمور VHP، الانحدار من الشبكات الشعرية من TVL، PM، وأخيرا، وHA يحدث في وقت لاحق2،3. وفي الوقت نفسه، يتراجع الجسم الزجاجي الأولي ويبدأ الجسم الزجاجي الثانوي في تشكيل، وتتألف من مكونات المصفوفة خارج الخلية، بما في ذلك ألياف الكولاجين. بحلول الشهر السادس من الحمل، يتم تقليل الجسم الزجاجي الأولي إلى قناة شفافة صغيرة تمتد من قرص العصب البصري إلى العدسة، وتسمى قناة كلوكيه أو قناة الهيالويد، ويصبح الجسم الزجاجي الثانوي المكون الرئيسي للجزء الخلفي 2 , 3.الدورة الدموية الهيالويد يختفي في الغالب في 35 إلى 36 أسابيع من الحمل، قبل الولادةمباشرة 3.
على عكس البشر، الذين يتم التراجع تماما الأوعية الدموية hyaloid عند الولادة، يبدأ نظام الأوعية الدموية هيالويد الماوس إلى التراجع بعد الولادة. كما يولد الشبكية الماوس الأوعية الدموية والشبكية تتطور بعد الولادة، والأوعية الهيالويد تتراجع في وقت واحد من يوم ما بعد الولادة (P) 4 ويتم التراجع تماما في الغالب من قبل P216 (الشكل1). يختفي PM أولا بين P10 و P12، ويختفي VHP بين P12 و P16، في حين أن عددا صغيرا من خلايا TVL وHA لا تزال حتى في P16، وP21 تراجع نظام الأوعية الدموية هيالويد هو كامل تقريبا6. في هذه الأثناء، تبدأ الأوعية الدموية الشبكية في التطور بعد الولادة. تمتد الطبقة السطحية من الضفيرة الوعائية بشكل كامل إلى الشبكية المحيطية في P7-P8، وتتطور الطبقة العميقة (الموجودة في طبقة plexiform الخارجية) من P7-P12، وأخيراً، تتطور الضفيرة المتوسطة في طبقة plexiform الداخلية بين P12 وP157 . كما يتطور الأوعية الدموية الشبكية، فإنه يحل تدريجيا محل وظيفة الأوعية الهيالويد تراجع في الوقت الذي ما يكون، وتوفير التغذية والأكسجين للعين النامية. يوفر حدوث تراجع الأوعية الهيالويدية بعد الولادة في الفئران نموذجاً تجريبياً يسهل الوصول إليه لمراقبة ودراسة الأوعية الدموية الهيالويدية، فضلاً عن الأساس الجزيئي الذي يحكم عمليات الانحدار الوعائي في إطار كل من الفسيولوجية و الظروف المرضية8.
يمكن رؤية فشل الانحدار الهيالويد في أمراض مثل PHPV ، وهو شذوذ نمو خلقي نادر للعين ناتج عن تراجع فاشل أو غير كامل في الأوعية الدموية الجنينية والزجاجية الأولية والهيالويد9. الآليات التي تنظم عملية الانحدار من الأوعية الدموية الهيالويد معقدة ومدروسة على نطاق واسع. أحد المسارات الجزيئية الرئيسية الضرورية للتراجع الطبيعي للأوعية الهيالويد هو مسار إشارة Wnt10، حيث تم ربط الطفرات الوراثية في هذا المسار التي تؤثر على كل من الليغانت والمستقبلات مع PHPV في البشر9. حددت الدراسات التجريبية الليغاد Wnt، Wnt7b، التي تنتجها الضامة حول الأوعية الهيالويد في العين النامية للتوسط في هذه العملية الانحدار. Wnt7b ينشط Wnt الإشارات عن طريق الربط مع مستقبلات frizzled4 (FZD4)/LRP5 في الخلايا البطانية المجاورة لبدء المبرمج الخلية، مما يؤدي إلى تراجع الأوعية الهيالويد10. ونتيجة لذلك، تظهر الفئران التي تعاني من نقص Wnt7bاستمرارا ً للأوعية الهيالويدية10. وبالمثل، فإن الرباط غير التقليدي Wnt، Norrin (المشفرة من قبل جين Ndp)، يربط أيضا إلى FZD4/LRP5 للحث على تراجع السفينة هيالويد أثناء التنمية. Ndpy/-, Lrp5-/-, و Fzd4-/- الفئران جميع عرض تأجيل تراجع السفينة hyaloid, دعم دور تنظيمي حاسم من Wnt إشارة11,12, 13،14،15،16. وعلاوة على ذلك، آخر Wnt coreceptor LRP6 يتداخل مع LRP5 في وظيفتها على تحوير مسار إشارة Wnt في الخلايا البطانية الوعائية هيالويد17. وتشمل العوامل الأخرى التي قد تسهم أيضا في الانحدار الهيالويد عامل نقص الأكسجة اللاتزاز18،19، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية20،21، الكولاجين-1822، 23، ARF24، أنجيوبويتين 225، والعظام البروتين المورفوجيجيني -426. في هذه الورقة، نستخدم Lrp5-/- الفئران كنموذج للأوعية الهيالويدة المستمرة لإثبات تقنيات تقييم وتوصيف الأوعية الدموية الهيالويدمنة من خلال كل من في الجسم الحي والأساليب الجسم الحي ة.
التصور من الأوعية الدموية الهيالويد في الجسم الحي والجسم الحي السابق أمر ضروري لدراسة آليات انحدار السفينة هيالويد. الأساليب الحالية لمراقبة الأوعية الدموية الهيالويد تركز أساسا على تصور وتحليل VHP وHA، من خلال صور OCT وFFA، والمقاطع العرضية للعين، وجبل مسطح هيالويد. OCT وFFA قوية في أدوات التصوير الحي، مما يسمح بالمراقبة الطولية في الحيوانات الحية بعد أن فتحت عيونهم. وعلاوة على ذلك، يوفر جبل مسطح معزول الهيالويد تصورا ً للأوعية الدموية الهيالويدية بأكملها ووسيلة لتحقيق تحديد دقيق لأرقام السفن. ومع ذلك فإن الطبيعة الحساسة والهشة للأوعية الهيالويدية والصعوبات التقنية الناتجة عن عزلتها قد حدت من استخدامها في أبحاث العيون إلى حد ما10و17و27. في هذه الورقة، نقدم بروتوكول مفصل من التصور من الأوعية الهيالويد، والجمع بين كل من في الجسم الحي التصوير الشبكية الحية والجسم الحي السابق معزولة هيالويد جبل مسطح لتعزيز جدوى هذه التقنيات. وقد تم تكييف هذا البروتوكول مع التعديل والتوسع من المنشورات السابقة على طريقة في الجسم الحي من fundus الحية وOCT التصوير28 وطريقة الجسم الحي من معزولة هيالويد شقة جبل11.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات تقييم وتوصيف الأوعية الهيالويدهية هي إجراءات بديهية وضرورية لمراقبة تراجع الأوعية الهيالويد في النماذج الحيوانية، للسماح بإجراء دراسات على الآليات الكامنة وراء تراجع الأوعية الدموية أثناء التنمية. في حين أن التصوير الشبكي في الجسم الحي يسمح بالمراقبة الطولية للانحدار الهيالوي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY024963 و EY028100) إلى J.C. Z.W. بدعم من منحة المبتدئين المهنية لمؤسسة فرسان تمبلر للعيون. تم تكييف إجراء عزل الهيالويد الموصوف في هذه الدراسة مع تعديل من البروتوكولات التي تقاسمها بسخاء الدكتور ريتشارد لانغ، توشيهيد كوريهارا، ولويس سميث، الذين يشكرون المؤلفين.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
