マウスにおけるヒアロイド血管の評価と特徴付け
Summary
このプロトコルは、生体イメージングとex vivoの両方の方法で、マウスの目の血管回帰モデルであるヒアロイド血管を完全に視覚化し、特徴付けする方法の両方について説明します。定量分析のためのヒヤロイドの分離および後続の平らな台紙。
Abstract
眼では、胚性ヒアロイド血管は、網膜血管が発達すると、発達するレンズと網膜に栄養を与え、回帰する。ヒアロイド血管の持続的または失敗した回帰は、持続性過形成原発性静脈(PHPV)などの疾患で見られ、閉塞した光経路および視覚機能障害につながる。ヒアロイド血管回帰の根底にあるメカニズムを理解することは、血管回帰プロセスに関する新しい分子洞察と、持続的なヒアロイド血管を有する疾患を管理する潜在的な新しい方法につながる可能性があります。ここでは、光コヒーレンス断層撮影(OCT)と眼球フルオレセイン血管造影(FFA)を用いた生きたマウスにおけるヒヤロイドのイメージング手順と、定量分析のためのヒヤロイドを分離およびフラットマウントする詳細な技術プロトコルについて説明する。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5(LRP5)ノックアウトマウスを、持続性ヒアロイド血管の実験モデルとして用い、その技術を例示した。これらの技術は、血管回帰の実験モデルとしてのヒアロイド血管の徹底的な評価と持続性ヒアロイド血管のメカニズムに関する研究を容易にする可能性がある。
Introduction
眼の血液供給は、網膜および周囲の眼組織の正常な発達を確保し、適切な視覚機能を備えるために不可欠である。眼には、網膜血管系、結状体、ヒアロイド血管の一過性胚循環ネットワークの3つの血管ベッドがあります。眼血管の発達は、胚発生および組織の成熟を通じて空間的および時間的な協調を必要とする。3つの血管床の中で、ヒアロイド血管系は、新たに形成された胚レンズおよび現像網膜に栄養および酸素を供給する最初の機能的な血液供給システムである。ヒヤロイド血管は、網膜血管が発達し、成熟すると同時に退行する。ヒアロイド血管系の回帰は、視覚機能の発達のための明確な視覚経路を可能にするために極めて重要である。したがって、この血管回帰プロセスは、静脈血管系の成長と同じくらい重要である。ヒアロイド回帰障害は眼疾患を引き起こす可能性がある。さらに、ヒアロイド血管の回帰は、血管回帰の調節に関与する細胞および分子機構を調べるためのモデルシステムを提供し、他の器官の血管新生調節にも影響を及ぼす可能性がある。
ヒアロイド動脈(HA)に由来するヒアロイド血管系は、バサ・ヒアロイデア・プロプリア(VHP)、チュニカ・バスクロサ・レンティス(TVL)、および瞳孔膜(PM)で構成される。これは、発生する網膜、一次静脈、および胚発生時のレンズに栄養を提供します2.HAから生じる、VHPはレンズへの静脈を通して前に分岐する。TVLはレンズカプセルの後面をカップし、アナストモスをPMに接続し、レンズ2、3の前面を覆い、PM内の血管のネットワークを形成する。3,4,5.興味深いことに、ヒアロイド血管系に静脈がなく、静脈の排水を達成するために、このシステムは甲状腺静脈を利用する。
ヒト胚では、ヒアロイド血管系は妊娠のおよそ9週目にほぼ完了し、最初の口骨血管が現れると、妊娠2の4ヶ月目に退行し始める。VHPの萎縮から始まり、TVLの毛細血管ネットワークの回帰、PM、そして最後に、HAはその後2、3が起こる。一方、一次静脈内引き込みおよび二次静脈は、コラーゲン繊維を含む細胞外マトリックス成分からなる形成を開始する。妊娠6ヶ月目までに、一次静脈は、視神経ディスクからレンズに伸びる小さな透明な運河に減少し、クロケットの運河またはヒアロイド管と呼ばれ、二次静脈は後部セグメントの主成分となる。2,3.ヒアロイド循環は、出産直前の妊娠35~36週でほとんど消滅し、3.
ヒアロイド血管系が出生時に完全に後退するヒトとは異なり、マウスヒアロイド血管系は出生後に後退し始める。マウス網膜が生まれ、網膜血管が生まれた後に発達するにつれて、ヒアロイド血管は出生後(P)4から同時に退行し、P21 6(図1)によってほとんど完全に後退する。PMはP10とP12の間で最初に消失し、VHPはP12とP16の間で消失し、少数のTVLおよびHA細胞はP16でも残り、P21によってヒヤロイド血管系回帰はほぼ完了する6である。その間、骨格は出生後に発症し始める。P7-P8では血管叢の表面層が完全に末梢網膜に広がり、P7-P12から深層(外プレキシフォーム層に位置する)が発達し、最後にP12とP15 7の間に中間プレクサスが発達する。.陰管血管が発達するにつれて、それは徐々に結び付け可能なヒアロイド血管の機能を置き換え、発達中の眼に栄養と酸素を提供する。マウスにおけるヒアロイド血管回帰の出生後の発生は、ヒアロイド血管系を観察し、研究するための容易にアクセス可能な実験モデルを提供し、生理学的および両方の下で血管回帰プロセスを支配する分子基盤を提供する。病理学的状態8.
ヒアロイド回帰の失敗は、胚学、原発性二頭状およびヒアロイド血管系の失敗または不完全な回帰に起因する眼の稀な先天性発達異常であるPHPVなどの疾患で見ることができる。ヒアロイド血管系の回帰過程を調節するメカニズムは複雑で広く研究されている。ヒアロイド血管の正常な回帰に不可欠な主要な分子経路の1つは、Wntシグナル伝達経路10であり、この経路における遺伝的変異がヒト9においてPHPVと関連している。実験的研究では、この回帰プロセスを仲介するために、現像眼のヒヤロイド血管の周りのマクロファージによって生成されるWntリガンドWnt7bを同定した。Wnt7bは、隣接する内皮細胞における受容体フリズルド4(FZD4)/LRP5との結合によりWntシグナル伝達を活性化し、細胞アポトーシスを開始し、ヒアロイド血管10の回帰を引き起こした。その結果、Wnt7b欠損マウスは、ヒアロイド血管10の持続性を示す。同様に、非従来型のWntリガンド、Norrin(Ndp遺伝子によってコードされる)も、開発中にヒアロイド血管回帰を誘導するためにFZD4/LRP5に結合する。Ndpy/-, Lrp5-/-およびFzd4-/-マウスはすべて、Wnt シグナル伝達11,12の重要な調節役割をサポートする延期されたヒヤロイド血管回帰を表示します。 13,14,15,16.さらに、別のWntコセプターLRP6は、ヒアロイド血管内皮細胞17におけるWntシグナル伝達経路を調節する上での機能においてLRP5と重なる。ヒアロイド回帰に寄与する可能性のある他の要因には、低酸素誘導因子18、19、血管内皮成長因子20、21、コラーゲン-1822、が含まれる。 23, Arf24, アンジオポエチン-25 , 骨形態形成タンパク質-426.本論文では、持続性ヒアロイド血管のモデルとしてLrp5-/-マウスを用いて、生体内法とex vivo法の両方を通じてヒヤロイド血管系を評価し特徴付ける技術を実証する。
生体内およびex vivoにおけるヒアロイド血管系の可視化は、ヒアロイド血管回帰のメカニズムを研究するために不可欠である。ヒアロイド血管を観察する現在の方法は、主にOCTおよびFFA画像、眼断面、およびヒアロイド平らなマウントを介して、VHPとHAを視覚化し、分析することに焦点を当てています。OCTおよびFFAは生体内イメージングツールに強力であり、目を開けた後に生きた動物の縦方向の観察を可能にする。さらに、隔離されたヒアロイドフラットマウントは、ヒヤロイド血管全体の可視化と容器数の正確な定量を達成するための手段を提供します。しかし、ヒアロイド血管の繊細で壊れやすい性質と、その分離の結果として生じる技術的な困難は、眼科研究における使用をいくらか制限している可能性があります10,17,27.本論文では、生体内の生きているレチナルイメージングとex vivo単離されたヒヤロイドフラットマウントの両方を組み合わせて、これらの技術の実現可能性を高めるために、ヒヤロイド血管の可視化の詳細なプロトコルを提供する。このプロトコルは、ライブファンダスおよびOCTイメージング28および単離されたヒヤロイドフラットマウント11のex vivo法に関する以前の出版物からの改変および拡張に適合している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒアロイド血管を評価し、特徴付ける技術は、動物モデルにおけるヒアロイド血管回帰を観察するために直感的かつ必要な手順であり、発達中の血管回帰の基礎となるメカニズムに関する研究を可能にする。生体内のレチナルイメージングは、同じ動物におけるヒアロイド回帰の縦方向の観察を可能にするが、OCTおよびFFAのためのげっ歯類眼球眼科イメージングシステムへのアクセスは、制?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金(R01 EY024963およびEY028100)がJ.C.Z.W.に支援し、ナイツテンプラーアイ財団キャリアスターター助成金によって支援されました。本研究で説明したヒアロイド分離手順は、リチャード・ラング博士、栗原俊英博士、ロイス・スミス博士が寛大に共有したプロトコルからの改変に適応した。
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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