Avaliação e caracterização de vasos Hialóides em camundongos
Summary
Este protocolo descreve os métodos in vivo e ex vivo para visualizar e caracterizar plenamente os vasos hialóides, um modelo de regressão vascular em olhos de rato, usando tomografia de coerência óptica e angiografia por fluoresceina de fundo para a imagem ao vivo e ex vivo isolamento e posterior montagem plana de hialóide para análise quantitativa.
Abstract
No olho, os vasos hialóides embrionários nutrem a lente e a retina em desenvolvimento e regredir quando os vasos retinianos se desenvolvem. A regressão persistente ou falhada de embarcações hialóide pode ser considerada nas doenças tais como o vítreo preliminar hyperplastic persistente (phpv), conduzindo a um trajeto claro obstruído e a uma função visual danificada. Compreender os mecanismos subjacentes à regressão do vaso hialóide pode levar a novas percepções moleculares sobre o processo de regressão vascular e novas formas potenciais de administrar doenças com vasos hialóides persistentes. Aqui nós descrevemos os procedimentos para a imagem latente hialóide em ratos vivos com tomography ótico da coerência (OCT) e a angiografia da fluoresceína do fundo (FFA) e um protocolo técnico detalhado de isolar e de montar liso hialoid ex vivo para a análise quantitativa. Os camundongos Knockout de proteína 5 (LRP5) da lipoproteína de baixa densidade foram utilizados como modelo experimental de vasos hialóides persistentes, para ilustrar as técnicas. Juntas, essas técnicas podem facilitar uma avaliação minuciosa dos vasos hialóides como modelo experimental de regressão vascular e estudos sobre o mecanismo de vasos hialóides persistentes.
Introduction
O suprimento sanguíneo no olho é essencial para garantir o desenvolvimento normal da retina e dos tecidos oculares circundantes e para equipar uma função visual adequada. Há três camas vasculares no olho: o vasculature retinal, o choroid, e uma rede circulatória embrionário transiente de embarcações hialóide. O desenvolvimento da vasculatura ocular requer coordenação espacial e temporal em toda a embriogênese e maturação tecidual. Entre as três camas vasculares, a vasculatura hialóide é o primeiro sistema de suprimento de sangue funcional para fornecer nutrição e oxigênio para a lente embrionária recém-formada e a retina em desenvolvimento. As embarcações de hyaloid regredir ao mesmo tempo que os vasculatures do retina desenvolvem e amadurecem1. A regressão da vasculatura hialóide é fundamental para permitir uma via Visual clara para o desenvolvimento da função Visual; Portanto, este processo de regressão vascular é tão importante quanto o crescimento da vasculatura retiniana. A regressão hialóide prejudicada pode levar a doenças oculares. Além disso, a regressão dos vasos hialóides fornece um sistema modelo para investigar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regulação da regressão vascular, o que pode ter implicações para a regulação angiogênica em outros órgãos também.
A vasculatura hialóide, derivada da artéria hialóide (ha), é composta por Vasa hyaloidea própria (VHP), Tunica lentis do cristalino (TVL) e membrana pupilar (PM). Fornece a nutrição à retina tornando-se, ao vitreous preliminar, e à lente durante o desenvolvimento embrionário2. Decorrente do HA, VHP ramifica-se anteriormente através do vítreo para a lente. Os copos TVL a superfície posterior da cápsula da lente, e anastomoses para o PM, que se conecta às artérias ciliares anteriores, cobrindo a superfície anterior da lente2,3, resultando na formação de uma rede de vasos no PM 3. º , 4. º , 5. Curiosamente, não há veias na vasculatura hialóide, e o sistema faz uso de veias choroidais para realizar a drenagem venosa.
No embrião humano, a vasculatura hialóide está quase completa em aproximadamente a nona semana de gestação e começa a regredar quando os primeiros vasos retinianos aparecem, durante o quarto mês de gestação2. Começando com a atrofia do VHP, a regressão das redes capilares do TVL, o PM, e finalmente, o ha ocorre subseqüentemente2,3. Entretanto, as retrações vítreo preliminares e o vítreo secundário começam a dar forma, compor dos componentes extracelular da matriz, incluindo fibras do colagénio. Pelo sexto mês da gestação, o vítreo preliminar é reduzido a um canal transparente pequeno que estende do disco do nervo ótico à lente, chamado o canal de Cloquet ou o canal hialóide, e o vítreo secundário transforma-se o componente principal do segmento do posterior 2. º , a circulação 3. The hialóide desaparece na maior parte em 35 a 36 semanas da gestação, apenas antes do nascimento3.
Ao contrário dos seres humanos, em quem o vasculatura hialóide é regressed completamente no nascimento, o sistema vascular hialóide do rato começa regres após o nascimento. À medida que a retina do camundongo nasce vasos avascular e retinianos desenvolvem-se postnatalmente, os vasos hialóides regredir concomitantemente do dia pós-natal (P) 4 e são, na sua maioria, completamente regredido por P216 (Figura 1). O PM desaparece primeiramente entre P10 e P12, e o VHP desaparece entre P12 e P16, quando um número pequeno de pilhas de TVL e de ha remanescer mesmo em P16, e por P21 a regressão vascular hialóide do sistema é quase completa6. Entretanto, a vasculatura retiniana começa a se desenvolver após o nascimento. A camada superficial do plexo vascular estende-se totalmente à retina periférica em P7 – P8, a camada profunda (localizada na camada plexiforme externa) se desenvolve a partir de P7 – P12 e, finalmente, o plexo intermediário na camada plexiforme interna se desenvolve entre P12 e P157 . Como a vasculatura da retina se desenvolve, ele gradualmente substitui a função de concomitantemente regressando vasos hialóides, proporcionando nutrição e oxigênio para o olho em desenvolvimento. A ocorrência pós-natal de regressão de vasos hialóides em camundongos fornece um modelo experimental de fácil acesso para observar e estudar a vasculatura hialóide, bem como a base molecular que rege os processos de regressão vascular ambos os fisiológicos e condições patológicas8.
A falha da regressão hialóide pode ser considerada nas doenças tais como o phpv, que é uma anomalia desenvolvente congenital rara do olho resultando de uma regressão falhada ou incompleta do vasculatura embriológico, preliminar vítreo e hialóide9. Os mecanismos que regulam o processo de regressão da vasculatura hialóide são complicados e amplamente estudados. Uma das principais vias moleculares essenciais para a regressão normal dos vasos hialóides é a via de sinalização WNT10, pois mutações genéticas nesta via que afetam tanto o ligante WNT quanto os receptores têm sido ligadas ao phpv em humanos9. Estudos experimentais identificaram um ligante de WNT, Wnt7b, que é produzido por macrófagos em torno de vasos hialóides no olho em desenvolvimento para mediar esse processo de regressão. Wnt7b ativa a sinalização de WNT ligando-se aos receptores frizzled4 (FZD4)/LRP5 nas células endoteliais adjacentes para iniciar a apoptose celular, levando à regressão dos vasos hialóides10. Em conseqüência, os ratos Wnt7b-deficientes mostram uma persistência de embarcações hialóide10. Similarmente, um ligante não convencional de WNT, Norrin (codificado pelo gene de NDP ), igualmente liga-se a FZD4/LRP5 para induzir a regressão hialóide da embarcação durante o desenvolvimento. NDPy/-, Lrp5-/-, e Fzd4-/- ratos todos exibem regressão de vasos hialóides adiados, apoiando um papel regulatório crítico da sinalização WNT11,12, 13,14,15,16. Além disso, um outro co-receptor de WNT LRP6 sobrepõe com o LRP5 em sua função em modular a via de sinalização de WNT em pilhas endothelial vasculares hialoid17. Outros fatores que podem também contribuir para a regressão hialóide incluem o fator inducible hipóxia18,19, fator de crescimento endotelial vascular20,21, colágeno-1822, 23, ARF24, angiopoietina-225e Proteína morfogenética óssea-426. Neste trabalho, utilizamos camundongos Lrp5-/- como modelo de vasos hialóides persistentes para demonstrar as técnicas de avaliação e caracterização da vasculatura hialóide através de métodos in vivo e ex vivo.
A visualização da vasculatura hialóide in vivo e ex vivo é essencial para o estudo dos mecanismos de regressão de vasos hialóides. Os métodos atuais para observar a vasculatura hialóide concentram-se principalmente na visualização e análise do VHP e HA, através de imagens de OCT e FFA, seções transversais oculares e a montagem plana hialóide. OCT e FFA são poderosas ferramentas de imagem in vivo, permitindo a observação longitudinal em animais vivos depois de terem aberto os olhos. Além disso, a montagem lisa hialóide isolada fornece o visualização do vasculatura hialóide inteiro e de um meio para conseguir uma quantificação exata dos números da embarcação. No entanto, a natureza delicada e frágil dos vasos hialóides e as dificuldades técnicas resultantes do seu isolamento podem ter limitado o seu uso na pesquisa ocular um pouco10,17,27. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo detalhado da visualização de vasos hialóides, combinando tanto in vivo imagens retinianas vivos e ex vivo isolado hialoide plano de montagem para melhorar a viabilidade dessas técnicas. Este protocolo foi adaptado com modificação e expansão de publicações anteriores sobre o método in vivo de fundo vivo e OCT28 e o método ex vivo de montagem plana hialóide isolada11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicas para avaliar e caracterizar vasos hialóides são procedimentos intuitivos e necessários para observar a regressão dos vasos hialóides em modelos animais, para permitir estudos sobre os mecanismos subjacentes à regressão vascular durante o desenvolvimento. Enquanto a imagem latente in vivo da retina permite a observação longitudinal da regressão hialóide no mesmo animal, o acesso a um sistema de imagem de fundo de roedores para OCT e FFA pode ser um fator limitante. Além, in vivo a imagem latente em r…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) subvenções (R01 EY024963 e EY028100) para J.C. Z.W. foi apoiado por um Knights Templar Eye Foundation carreira Starter Grant. O procedimento de isolamento hialóide descrito neste estudo foi adaptado com modificação de protocolos generosamente compartilhados pelos Drs. Richard Lang, Toshihide Kurihara, e Lois Smith, a quem os autores são gratos.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
