Vurdering og karakterisering av Hyaloid fartøy i mus
Summary
Denne protokollen beskriver både in vivo og ex vivo metoder for fullt visualisere og karakterisere hyaloid fartøy, en modell av vaskulær regresjon i muse øyne, ved hjelp av optisk sammenheng tomografi og fundus fluorescein angiografi for Live Imaging og ex vivo og påfølgende flatmontering av hyaloid for kvantitativ analyse.
Abstract
I øyet, den embryonale hyaloid fartøy ernære utvikle linsen og Retina og regress når retinal fartøy utvikle. Vedvarende eller mislykket regresjon av hyaloid fartøy kan sees i sykdommer som vedvarende hyperplastisk primære glasslegemet (PHPV), fører til en hindret lys bane og nedsatt visuell funksjon. Forstå mekanismene underliggende hyaloid fartøyet regresjon kan føre til ny molekylær innsikt i vaskulær regresjon prosessen og potensielle nye måter å håndtere sykdommer med vedvarende hyaloid fartøy. Her beskriver vi prosedyrene for Imaging hyaloid i live mus med optisk sammenheng tomografi (OCT) og fundus fluorescein angiografi (FFA) og en detaljert teknisk protokoll for å isolere og flat-montering hyaloid ex vivo for kvantitativ analyse. Lav tetthet lipoprotein reseptor-relaterte protein 5 (LRP5) knockout mus ble brukt som en eksperimentell modell av vedvarende hyaloid fartøy, for å illustrere teknikkene. Sammen, disse teknikkene kan forenkle en grundig vurdering av hyaloid fartøy som en eksperimentell modell av vaskulær regresjon og studier på mekanismen av vedvarende hyaloid fartøy.
Introduction
Blodtilførselen i øyet er avgjørende for å sikre normal utvikling av netthinnen og omkringliggende øye vev og å utstyre en riktig visuell funksjon. Det er tre vaskulære senger i øyet: retinal blodkar, akkord, og en forbigående embryonale sirkulasjons nettverk av hyaloid fartøy. Utviklingen av øye blodkar krever romlig og timelig koordinering gjennom embryogenesis og vevs modning. Blant de tre vaskulære senger, er hyaloid blodkar den første funksjonelle blodtilførsel system for å gi næring og oksygen til den nyopprettede embryonale linsen og utvikle netthinnen. Hyaloid fartøy regress på samme tid som Retina vasculatures utvikle og modne1. Den regresjon av hyaloid blodkar er avgjørende for å tillate en klar visuell vei for utvikling av visuell funksjon; Derfor er dette vaskulær regresjon prosessen like viktig som veksten av retinal blodkar. Nedsatt hyaloid regresjon kan føre til øyesykdommer. Videre gir regresjon av hyaloid fartøy en modell system for å undersøke cellulære og molekylære mekanismer involvert i regulering av vaskulær regresjon, som kan ha implikasjoner for angiogenic regulering i andre organer også.
Hyaloid blodkar, avledet fra hyaloid arterien (HA), er sammensatt av Vasa hyaloidea propria (VHP), tunika vasculosa lentis (TVL), og Pupillary membran (PM). Det gir næring til å utvikle netthinnen, den primære glasslegemet, og linsen under embryonale utviklingen2. Som følge av HA, VHP grener anteriort gjennom glasslegemet til linsen. Den TVL kopper bakre overflaten av linsen kapselen, og anastomoser til PM, som kobles til fremre ciliary arterier, som dekker den fremre overflaten av objektivet2,3, noe som resulterer i dannelsen av et nettverk av fartøy i PM 3 andre priser , 4 andre priser , 5. interessant, det er ingen årer i hyaloid blodkar, og systemet gjør bruk av koroidal årer for å oppnå venøs drenering.
I det menneskelige embryo, den hyaloid blodkar er nesten fullført på omtrent den niende uken av svangerskapet og begynner å regress når de første retinal fartøy vises, i løpet av den fjerde måneden av svangerskapet2. Begynner med atrofi av VHP, regresjon av kapillær nettverk av TVL, PM, og til slutt, det ha skjer senere2,3. I mellomtiden begynner den primære glasslegemet trekkes og den sekundære glasslegemet til å danne, sammensatt av ekstracellulære matrise komponenter, inkludert kollagen fibre. Ved den sjette måneden av svangerskapet, er den primære glasslegemet redusert til en liten gjennomsiktig kanal som strekker seg fra optisk nerve platen til linsen, kalt Cloquet kanal eller hyaloid kanalen, og den sekundære glasslegemet blir den viktigste komponenten i bakre segmentet 2 andre priser , 3. The hyaloid sirkulasjon forsvinner det meste på 35 til 36 uker av svangerskapet, like før fødselen3.
I motsetning til mennesker, i hvem hyaloid blodkar er helt regressed ved fødselen, begynner musen hyaloid vaskulære systemet til regress etter fødselen. Som musen Retina er født Avascular og retinal fartøy utvikle fødselen, hyaloid fartøy regress samtidig fra postnatal dag (P) 4 og er for det meste helt regressed av P216 (figur 1). Den PM forsvinner først mellom P10 og P12, og VHP forsvinner mellom P12 og P16, mens et lite antall TVL og HA celler forblir selv på P16, og ved P21 hyaloid vaskulær system regresjon er nesten komplett6. I mellomtiden begynner retinal blodkar utvikle etter fødselen. Det overfladiske laget av vaskulær plexus strekker seg helt til den perifere Retina på P7-P8, det dype laget (ligger i det ytre plexiform lag) utvikler fra P7 – P12, og til slutt, mellomliggende plexus i det indre plexiform laget utvikler mellom P12 og P157 . Som retinal blodkar utvikler, det gradvis erstatter funksjonen av samtidig regressing hyaloid fartøy, som gir næring og oksygen til å utvikle øyet. Den postnatal forekomsten av hyaloid fartøy regresjon i mus gir en lett tilgjengelig eksperimentell modell for å observere og studere hyaloid blodkar, samt molekylær grunnlaget for vaskulær regresjon prosesser under både fysiologiske og patologiske tilstander8.
Unnlatelse av hyaloid regresjon kan sees i sykdommer som PHPV, som er en sjelden medfødt utviklingsmessige anomali av øyet som følge av en mislykket eller ufullstendig regresjon av embryological, primær glasslegemet og hyaloid blodkar9. Mekanismene som regulerer regresjon prosessen av hyaloid blodkar er kompliserte og grovt studert. En stor molekylær sti avgjørende for normal regresjon av hyaloid fartøy er wnt signalering Pathway10, som genetiske mutasjoner i denne veien påvirker både wnt ligand og reseptorer har vært knyttet til PHPV i mennesker9. Eksperimentelle studier identifiserte en wnt ligand, Wnt7b, som er produsert av makrofager rundt hyaloid fartøy i utviklings øye å megle denne prosessen regresjon. Wnt7b aktiverer wnt signalering ved binding med reseptorene frizzled4 (FZD4)/LRP5 i tilstøtende endothelial celler for å initiere celle apoptose, fører til regresjon av hyaloid fartøy10. Som et resultat, Wnt7b-mangelfull mus viser en utholdenhet av hyaloid fartøy10. Tilsvarende, en uvanlige stavevariasjoner wnt ligand, Norrin (kodet av NDP Gene), binder også til FZD4/LRP5 å indusere den hyaloid fartøyet regresjon under utvikling. NDPy/-, Lrp5-/-, og Fzd4-/- mus alle skjerm utsatt hyaloid fartøy regresjon, støtte en kritisk regulatoriske rolle wnt signalering11,12, 13,14,15,16. Videre, en annen wnt coreceptor LRP6 overlapper med LRP5 i deres funksjon på modulerende den wnt signalering veien i hyaloid vaskulær endothelial celler17. Andre faktorer som også kan bidra til hyaloid regresjon inkluderer hypoksi-induserbart faktor18,19, vaskulær endothelial vekstfaktor20,21, kollagen-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225, og bein Morfogenetiske protein-426. I denne utredningen bruker vi Lrp5-/- mus som en modell av vedvarende hyaloid fartøy for å demonstrere teknikker for vurdering og karakteriserer av hyaloid blodkar gjennom både in vivo-og ex vivo-metoder.
Visualiseringen av hyaloid blodkar in vivo og ex Vivo er avgjørende for å studere mekanismene for hyaloid fartøy regresjon. Gjeldende metoder for å observere hyaloid blodkar hovedsakelig fokusere på å visualisere og analysere VHP og HA, gjennom OCT og FFA bilder, øye kryss seksjoner, og hyaloid flat Mount. OCT og FFA er kraftige in vivo Imaging verktøy, slik at langsgående observasjon i levende dyr etter at de har åpnet øynene. Videre, isolert hyaloid flat Mount gir visualisering av hele hyaloid blodkar og et middel for å oppnå en nøyaktig kvantifisering av fartøyet tall. Men den delikate og skjøre natur hyaloid fartøy og de resulterende tekniske vanskeligheter av sin isolasjon kan ha begrenset bruken i øye forskning noe10,17,27. I denne utredningen gir vi en detaljert protokoll for visualisering av hyaloid fartøy, som kombinerer både in vivo Live Retinal Imaging og ex vivo isolert hyaloid flatt feste for å øke muligheten for disse teknikkene. Denne protokollen er tilpasset med modifisering og utvidelse fra tidligere publikasjoner på in vivo-metoden for Live fundus og OCT Imaging28 og ex vivo-metoden til isolert hyaloid flat Mount11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikker for å vurdere og karakterisere hyaloid fartøy er intuitive og nødvendige prosedyrer for å observere hyaloid fartøyet regresjon i dyremodeller, for å tillate studier på mekanismene underliggende vaskulær regresjon under utvikling. Mens in vivo Retinal Imaging tillater langsgående observasjon av hyaloid regresjon i samme dyr, tilgang til en gnager fundus Imaging system for OCT og FFA kan være en begrensende faktor. I tillegg er in vivo Imaging i levende mus ikke gjennomførbart før de åpner øynene. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (R01 EY024963 og EY028100) til JC Z.W. ble støttet av Knights Templar Eye Foundation Career starter Grant. Den hyaloid isolasjons prosedyren som er beskrevet i denne studien, er tilpasset endringer fra protokoller som er sjenerøst delt av DRS. Richard lang, Toshihide Kurihara, og Lois Smith, som forfatterne er takknemlig for.
Materials
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
References
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J., Besharse, J., Bok, D. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and its Disorders. , (2011).
- Hobbs, R. P., Hartnett, M. E., Hartnett, M. E. Chapter 2: The hyaloidal vasculature and its role in development. Pediatric Retina: Second Edition. , (2013).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Saint-Geniez, M., D’Amore, P. A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 1045-1058 (2004).
- Ito, M., Yoshioka, M. Regression of the hyaloid vessels and pupillary membrane of the mouse. Anatomy and Embryology. 200 (4), 403-411 (1999).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Shastry, B. S. Persistent hyperplastic primary vitreous: congenital malformation of the eye. Clinical & Experimental Ophthalmology. 37 (9), 884-890 (2009).
- Lobov, I. B., et al. WNT7b mediates macrophage-induced programmed cell death in patterning of the vasculature. Nature. 437 (7057), 417-421 (2005).
- Kato, M., et al. Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and persistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt coreceptor. The Journal of Cell Biology. 157 (2), 303-314 (2002).
- Xia, C. H., et al. A model for familial exudative vitreoretinopathy caused by LPR5 mutations. Human Molecular Genetics. 17 (11), 1605-1612 (2008).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Ye, X., et al. Norrin, frizzled-4, and Lrp5 signaling in endothelial cells controls a genetic program for retinal vascularization. Cell. 139 (2), 285-298 (2009).
- Ohlmann, A. V., Adamek, E., Ohlmann, A., Lutjen-Drecoll, E. Norrie gene product is necessary for regression of hyaloid vessels. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2384-2390 (2004).
- Chen, J., et al. Retinal expression of Wnt-pathway mediated genes in low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (Lrp5) knockout mice. PLoS One. 7 (1), 30203 (2012).
- Nayak, G., et al. Developmental vascular regression is regulated by a Wnt/beta-catenin, MYC and CDKN1A pathway that controls cell proliferation and cell death. Development. 145 (12), (2018).
- Kurihara, T., et al. Astrocyte pVHL and HIF-alpha isoforms are required for embryonic-to-adult vascular transition in the eye. The Journal of Cell Biology. 195 (4), 689-701 (2011).
- Huang, T. Q., et al. Deletion of HIF-1alpha partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes. Molecular Vision. 18, 1260-1270 (2012).
- Yoshikawa, Y., et al. Developmental regression of hyaloid vasculature is triggered by neurons. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1175-1183 (2016).
- Garcia, C. M., et al. The function of VEGF-A in lens development: formation of the hyaloid capillary network and protection against transient nuclear cataracts. Experimental Eye Research. 88 (2), 270-276 (2009).
- Hurskainen, M., et al. Abnormal maturation of the retinal vasculature in type XVIII collagen/endostatin deficient mice and changes in retinal glial cells due to lack of collagen types XV and XVIII. FASEB journal. 19 (11), 1564-1566 (2005).
- Fukai, N., et al. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. The EMBO Journal. 21 (7), 1535-1544 (2002).
- McKeller, R. N., et al. The Arf tumor suppressor gene promotes hyaloid vascular regression during mouse eye development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3848-3853 (2002).
- Hackett, S. F., Wiegand, S., Yancopoulos, G., Campochiaro, P. A. Angiopoietin-2 plays an important role in retinal angiogenesis. Journal of Cellular Physiology. 192 (2), 182-187 (2002).
- Chang, B., et al. Haploinsufficient Bmp4 ocular phenotypes include anterior segment dysgenesis with elevated intraocular pressure. BMC Genetics. 2, 18 (2001).
- Wang, Z., et al. Pharmacologic Activation of Wnt Signaling by Lithium Normalizes Retinal Vasculature in a Murine Model of Familial Exudative Vitreoretinopathy. The American Journal of Pathology. 186 (10), 2588-2600 (2016).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PLoS One. 10 (7), 0132643 (2015).
- Kishimoto, A., et al. Histochemical characteristics of regressing vessels in the hyaloid vascular system of neonatal mice: Novel implication for vascular atrophy. Experimental Eye Research. 172, 1-9 (2018).
- Lang, R. A., Bishop, J. M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 74 (3), 453-462 (1993).
- Riazifar, H., et al. Phenotypic and functional characterization of Bst+/- mouse retina. Disease Models & Mechanisms. 8 (8), 969-976 (2015).
