نماذج Xenograft المتوارثية المستمدة من المريض لسرطان الخلايا البولية البشرية ونمو ورم سرطان القولون والمستقيم وورم الانبثاث العفوي
Summary
يصف هذا البروتوكول توليد نماذج xenograft المتقوّدة من قبل المريض من خلال غرس خلايا سرطان الخلايا البولية عالية الجودة أو خلايا سرطان القولون والمستقيم داخل المستقيم في مرض السكري غير البدين / شديد مجتمعة الفئران نقص المناعة (NOD / SCID) لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا اللمفية سترومال العقدة، والتي تحاكي تطور الأمراض النقيلية البشرية.
Abstract
يعاني مرضى السرطان من ضعف التكهن عند وجود مشاركة العقدة الليمفاوية (LN) في كل من سرطان الخلايا البولية عالي الجودة (HG-UCC) من المثانة وسرطان القولون والمستقيم (CRC). أكثر من 50٪ من المرضى الذين يعانون من UCC الغازية العضلات، على الرغم من العلاج العلاجي للأمراض الموضعية سريريا، سوف تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات، وCRC النقيلي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة. هناك حاجة إلى نماذج Xenograft التي تحاكي باستمرار UCC وCRC الانبثاث ينظر في المرضى. تهدف هذه الدراسة إلى توليد نماذج xenograft (PDOX) المستمدة من المريض من UCC وCRC لنمو الورم الأولي والانبثاث التلقائي تحت تأثير الخلايا سترومال LN تقليد تطور الأمراض النقيلية البشرية لفحص المخدرات. تم الحصول على أورام جديدة UCC وCRC من المرضى الذين تمت الموافقة عليهم الذين يخضعون لعملية استئصال لHG-UCC وسرطان الغدة الدرقية القولون والمستقيم، على التوالي. التلقيح المشترك مع الخلايا السترومال LN (LNSC) الخلايا التناظرية هونج كونج، والخلايا UCC الموسومة لوسيفيراز كانت داخل vesically (IB) غرست في الإناث غير السمنة السكري / شديدة الفئران نقص المناعة مجتمعة (NOD / SCID)، وكانت خلايا CRC داخل المستقيم (IR) حقن في ذكر NOD / SCID الفئران. تم رصد نمو الورم وورم خبيث أسبوعيا باستخدام التصوير الإنارة الحيوية (BLI). عند التضحية، تم حصاد الأورام الأولية وأجهزة الماوس، ووزنها، وثبت رسميًا للهيماتوكسيلين وإيوسين وتلطيخ الكيمياء المناعية. في نماذج PDOX الفريدة من نوعها، تشبه أورام xenograft أورام المريض قبل الزرع. في وجود خلايا هونج كونج، كلا النموذجين لديها معدلات زرع الورم عالية تقاس بـ BLI وأوزان الورم، 83.3٪ لUCC و 96.9٪ للجنة حقوق الطفل، وارتفاع معدلات الانبثاث عن الأعضاء البعيدة (33.3٪ الكشف عن الكبد أو سرطان الرئة لUCC و 53.1٪ لCRC). وبالإضافة إلى ذلك، فإن كلا النموذجين لا يحتويان على أي معدل وفيات بسبب هذا الإجراء. لقد أنشأنا نماذج PDOX فريدة من نوعها قابلة للاستنساخ لـ HG-UCC وCRC البشرية، والتي تسمح لتكوين الورم، والنمو، ودراسات الانبثاث. مع هذه النماذج، يمكن إجراء اختبار الأدوية العلاجية الجديدة بكفاءة وبطريقة تمثيلية.
Introduction
وقد تبين أن العقدة الليمفاوية (LN) الانبثاث هو مؤشر التكهن الفقراء في العديد من الأورام الخبيثة الأعضاء الصلبة، بما في ذلك سرطان الخلايا البولية عالية الجودة (UCC) من سرطان المثانة والقولون والمستقيم (CRC)1،2. أكثر من نصف المرضى الذين يعانون من UCC الغازية العضلات (MIUCC)، على الرغم من العلاج العلاجي للمرض الموضعي سريريا، سوف تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات. تعتبر اتفاقية حقوق الطفل النقيلية أحد الأسباب الرئيسية للوفاة المرتبطة بالسرطان في الولايات المتحدة.
ومن المتوقع أن يحدث ما يقدر بـ 81,190 مريض جديد و17,240 حالة وفاة خاصة بالسرطان في عام 2018 في الولايات المتحدة بسبب UCC من المثانة3,4. في حين أن المرضى سوف في الغالب (70٪) الحالي مع مرض الغازية غير العضلات، وسوفيكون 30٪ MIUCC 5. على الرغم من العلاج العلاجي (استئصال المثانة الجذري [RC] مع أو بدون العلاج الكيميائي الجهازي) للمرض الموضعي سريريا، فإن نصف المرضى الذين يعانون من MIUCC من المثانة لا تزال تتطور الانبثاث ويموتون في غضون 5 سنوات3. تم العثور على مشاركة العقدة الليمفاوية في ما يقرب من 20٪ -25٪ من المرضى الذين خضعوا RC6،7،8. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات في المرضى إيجابية LN هو أقل من 35٪ حتى بعد RC، مما يشير إلى مشاركة LN كتوقع سلبي حاسم للتشخيص في المرضى UCC.
سرطان القولون والمستقيم هو ثالث أكثر حالات السرطان شيوعًا في كل من الرجال والنساء في الولايات المتحدة. تعتمد نتائج المريض إلى حد كبير على خصائص الورم والبيئة الدقيقة للورم، مثل عمق الغزو، ومشاركة LN، ونقائل الأعضاء البعيدة. على الرغم من أن معدل الوفيات في لجنة حقوق الطفل انخفض في العقد الماضي بسبب الفحص والعمليات الجراحية الفعالة، ويقدر أن ما يقرب من 50٪ من مرضى CRC سوف تتطور الانبثاث أو الأمراض المتكررة9.
توفر النماذج الحيوانية الصغيرة منصة سريعة وقابلة للاستنساخ وقابلة للتعديل لدراسة تطور الورم وأنماط النقيلي المختلفة. لا توجد حاليًا نماذج xenograft موصوفة تحاكي باستمرار CRC وUCC metastasis ينظر إليها في المرضى. الطريق الرئيسي للورم النقي للسرطان هو عن طريق انتشار اللمفاوية. تشير الأبحاث الجديدة إلى أن الـ LNs توفر الأورام ببيئة دقيقة فريدة من نوعها، وليست مجرد أهداف ثابتة حيث تمر الخلايا السرطانية بشكل عابر، ولكنها تلعب أيضًا دورًا أساسيًا من خلال التفاعل مع الخلايا السرطانية في العملية النقيلية. في الواقع، اكتشفت دراساتنا أنه، بالإضافة إلى تعليم وتعزيز تطور الورم والانبثاث، فإن البيئة الدقيقة سترومال LN مسؤولة أيضا عن مقاومة المخدرات في CRC10،11. أكد مختبرنا مؤخرا الآثار السرطانية للخلايا سترومال LN (LNSCs) على CRC وUCCs باستخدام نماذج الماوس xenograft المتوارثية المستمدة من المريض (PDOX)12،13.
تطوير نماذج PDOX يوفر منصة هامة لبحوث السرطان الترجمة14،15. من خلال الحفاظ على الخصائص الأنسجة والوراثية الرئيسية للورم المانح، نماذج PDOX تبقى مستقرة عبر الممرات وجعل منصات جيدة لبحوث السرطان الترجمة12،15. يتم استخدام نماذج PDOX لتقييم الأدوية قبل السريرية، وتحديد العلامات الحيوية، والتقييم قبل السريرية لاستراتيجيات الطب الشخصية التي تسمح للتنبؤ بالنتائج السريرية. حاليا، لا توجد نماذج xenograft الموصوفة التي تنظر في أهمية مشاركة LN وقادرة على استنساخ باستمرار الورم الأساسي وورم الأعضاء البعيد في CRC وUCC. في هذه الدراسة، ونحن نصف تطور نماذج PDOX في الفئران NOD / SCID مع استنساخ CRC النقيلي والأمراض UCC مع مشاركة LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
المرض النقيلي هو المسؤول عن معظم وفيات مرضى السرطان. في الاختبارات العلاجية قبل السريرية، من المهم جداً إنشاء نماذج الماوس التي تحاكي نمو الورم البشري بشكل وثيق مع الانبثاث الجهاز البعيد التلقائي. استخدام نماذج المورين مع زرع الخلايا السرطانية المشتقة من ورم المريض (xenografts) يسمح لفهم أفضل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون برايان رويتر، ودانييل بيرتوني، وبيتر ميلر، وشانون ماتشيسني الذين ساعدوا في بدء هذه الدراسات على دعمهم التقني الممتاز. كما يشكر المؤلفون هيذر غرين ماترانا ومارغريت فاريانو وسونيل تالوار وماريا لاتسي على مساعدتهم في مساعدة المرضى على الموافقة وتوفير عينات الورم.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
