Pasient-avledet Orthotopic Xenograft modeller for Human Urotelialt Cell kreft og tykktarmskreft tumor vekst og spontan metastasering
Summary
Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledet orthotopic xenograft modeller av intra-vesically instilling høyverdig urotelialt celle kreftceller eller intra-rektalt injisere tykk kreftceller i ikke-overvektige diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NOD/SCID) mus for primær tumor vekst og spontan metastaser under påvirkning av lymfeknuter stromal celler, som etterligner progresjon av menneskelige metastatisk sykdommer.
Abstract
Kreftpasienter har dårlig prognoser når lymfe node (LN) engasjement er tilstede i både høyverdig urotelialt celle kreft (HG-UCC) av blæren og tykktarmskreft (CRC). Mer enn 50% av pasientene med muskel-invasiv UCC, til tross for helbredende terapi for klinisk lokalisert sykdom, vil utvikle metastaser og dø innen 5 år, og metastatisk CRC er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i USA. Xenograft modeller som konsekvent etterligner UCC og CRC metastasering sett hos pasienter er nødvendig. Denne studien har som mål å generere pasient-avledet orthotopic xenograft (PDOX) modeller av UCC og CRC for primær tumor vekst og spontan metastaser under påvirkning av LN stromal celler etterligne progresjon av menneskelig metastatisk sykdommer for narkotika screening. Fresh UCC og CRC svulster ble innhentet fra samtykket pasienter gjennomgår reseksjon for HG-UCC og tykk adenokarsinom, henholdsvis. Co-inokulert med LN stromal celle (LNSC) analoge HK celler, luciferase-merkede UCC celler var intra-vesically (IB) innpodet i kvinnelige ikke-overvektige diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NOD/SCID) mus, og CRC celler var intra-rektalt (IR) injisert i mannlige NOD/SCID mus. Tumor vekst og metastasering ble overvåket ukentlig ved hjelp av bioluminesens Imaging (BLI). Ved offer, primære svulster og mus organer ble høstet, veid, og formalin for Hematoksylin og Eosin og immunhistokjemi farging. I vår unike PDOX modeller, xenograft svulster ligne pasienten pre-implantation svulster. I nærvær av HK celler, begge modellene har høy tumor implantation priser målt ved BLI og tumor vekter, 83,3% for UCC og 96,9% for CRC, og høy fjernt organ metastasering priser (33,3% oppdaget lever eller lunge metastasering for UCC og 53,1% for CRC). I tillegg har begge modellene null dødelighet fra prosedyren. Vi har etablert unike, reproduserbar PDOX modeller for menneskelig HG-UCC og CRC, som gir mulighet for tumor dannelse, vekst, og metastasering studier. Med disse modellene kan testing av nye terapeutiske stoffer utføres effektivt og på en klinisk mimetisk måte.
Introduction
Det har blitt vist at lymfeknuter (ln) metastasering er en dårlig Prognostisk indikator i mange solide organ ondartet, inkludert høyverdig urotelialt celle kreft (UCC) av blæren og tykktarmskreft (CRC)1,2. Over halvparten av pasientene med muskel-invasiv UCC (MIUCC), til tross for helbredende terapi for klinisk lokalisert sykdom, vil utvikle metastaser og dø innen 5 år. Metastatisk CRC er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i USA.
Anslagsvis 81 190 nye pasienter og 17 240 Cancer spesifikke dødsfall forventes å forekomme i 2018 i USA på grunn av UCC av blæren3,4. Mens pasientene vil overveiende (70%) tilstede med ikke-muskel invasiv sykdom, 30% vil ha MIUCC5. Til tross for helbredende terapi (radikal cystectomy [RC] med eller uten systemisk kjemoterapi) for klinisk lokalisert sykdom, vil halvparten av pasientene med MIUCC av blæren fortsatt utvikle metastaser og dø innen 5 år3. Det finnes involvering av lymfeknuter i ca. 20% − 25% av pasientene som har gjennomgått RC6,7,8. Fem års overlevelsesrate hos LN-positive pasienter er mindre enn 35%, selv etter RC, noe som tyder LN-engasjement som en avgjørende negativ indikasjon på prognosen hos pasienter med UCC.
Tykktarmskreft er den tredje vanligste kreftdiagnosen hos både menn og kvinner i USA. Pasienten utfall i stor grad avhengig av tumor egenskaper og tumor mikromiljøet, slik som dybden av invasjonen, LN engasjement, og fjernt organ metastaser. Selv om dødeligheten i CRC redusert i det siste tiåret på grunn av screening og effektive operasjoner, er det anslått at nesten 50% av CRC pasienter vil utvikle metastaser eller tilbakevendende sykdom9.
Små dyremodeller gir en rask, reproduserbar og redigerbart plattform for å studere tumorprogresjon og ulike metastatisk mønstre. Det er for tiden ingen beskrevet xenograft modeller som konsekvent etterligner CRC og UCC metastasering sett hos pasienter. Den primære ruten for kreft Fjern metastasering er via lymfatisk spredning. Ny forskning tyder på at LNs gi svulster med en unik mikromiljøet, og er ikke bare rett og slett stasjonære mål der kreftceller midlertidig pass, men også spille en viktig rolle ved å samhandle med kreftceller i metastatisk prosess. Faktisk, våre studier oppdaget at i tillegg til å utdanne og fremme tumorprogresjon og metastaser, LN stromal mikromiljøet er også ansvarlig for resistens i CRC10,11. Vår Lab nylig bekreftet tumorigene effekter av ln stromal celler (LNSCs) på CRC og UCCs bruker pasient-avledet orthotopic xenograft (PDOX) mus modeller12,13.
Utvikle PDOX modeller gir en viktig plattform for translational Cancer Research14,15. Ved å opprettholde de viktigste histologic og genetiske egenskapene til deres donor tumor, PDOX modeller forbli stabile på tvers av passasjer og gjøre gode plattformer for translational Cancer Research12,15. PDOX modeller blir brukt for prekliniske narkotika evaluering, biomarkør identifisering, og prekliniske evaluering av personlig medisin strategier som muliggjør prediksjon av kliniske utfall. Foreløpig er det ingen beskrevet xenograft modeller som betrakter viktigheten av LN engasjement og er i stand til konsekvent gjengivelse primære tumor og fjernt organ metastasering i CRC og UCC. I denne studien beskriver vi utviklingen av PDOX-modeller i NOD/SCID-mus med reproduksjon av metastatisk CRC-og UCC-sykdommer med LNSC-involvering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metastatisk sykdom er ansvarlig for de fleste kreft pasient dødelighet. I pre-kliniske terapeutiske tester, er det avgjørende å etablere musemodeller som nærmest etterligne menneskelig tumor vekst med spontane fjernt organ metastaser. Bruke murine modeller med implantert pasient tumor avledet kreftceller (xenotransplantater) gir en bedre forståelse av tumor biologi og prediktiv biomarkører samt testing og prediksjon av antineoplastiske effekter av romanen terapi18. Mange modeller har blitt b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, og Shannon McChesney som bidro til å initiere disse studiene for deres utmerkede teknisk støtte. Forfatterne takker også Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar, og Maria Latsis for assistanse i samtykkende pasienter og gi tumor prøver.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
