Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea
Summary
Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.
Abstract
Os pacientes com câncer têm prognósticos pobres quando o envolvimento do linfonodo (ln) está presente no carcinoma de células urotelial de alto grau (Hg-UCC) da bexiga e câncer colorretal (CRC). Mais de 50% dos pacientes com UCC músculo-invasor, apesar da terapia curativa para a doença clìnica-localizada, desenvolverão metástases e morrem dentro de 5 anos, e o CRC metastático é uma causa principal de mortes Cancer-relacionadas nos E.U. Os modelos de xenograft que imitam consistentemente a metástase de UCC e de CRC vistos nos pacientes são necessários. Este estudo visa gerar modelos de Xenoenxerto ortotópico derivado do paciente (PDOX) de UCC e CRC para o crescimento primário do tumor e metástases espontâneas a influência de células estromais do LN, imitando a progressão de doenças metastáticas humanas para triagem de fármacos. Os tumores frescos de UCC e de CRC foram obtidos dos pacientes consentiu que submetem-se ao Resection para HG-UCC e adenocarcinoma colorretal, respectivamente. Co-inoculated com as pilhas análogas da HK da pilha do stromal do ln (lnsc), as pilhas luciferase-etiquetadas de UCC eram intra-vesically (IB) instilado em ratos não-obesos fêmeas do diabético/imunodeficiência combinada severa (nod/scid), e as pilhas de CRC eram intra-rectal (ir) injetada camundongos NOD/SCID masculinos. O crescimento e a metástase do tumor foram monitorados semanalmente usando a imagem latente do bioluminescência (bli). Em cima do sacrifício, os tumores preliminares e os órgãos do rato foram colhidos, pesados, e formalin-fixados para a coloração do hematoxylin e do Eosin e do immunohistochemistry. Em nossos modelos originais de PDOX, os tumores do xenograft assemelham-se aos tumores pacientes do pre-implante. Na presença de células de HK, ambos os modelos apresentam altas taxas de implante tumoral mensuradas por BLI e pesos tumorais, 83,3% para a UCC e 96,9% para CRC, e altas taxas de metástase de órgãos distantes (33,3% detectaram metástase hepática ou pulmonar para a UCC e 53,1% para CRC). Além disso, ambos os modelos têm mortalidade zero a partir do procedimento. Nós estabelecemos modelos originais, reprodutíveis de PDOX para o HG-UCC e o CRC humanos, que permitem a formação do tumor, o crescimento, e os estudos da metástase. Com estes modelos, o teste de drogas terapêuticas novas pode ser executado eficientemente e em uma maneira clìnica-mimmetic.
Introduction
Demonstrou-se que a metástase do nó de linfa (ln) é um indicador prognóstico pobre em muitas malignidades sólidas do órgão, incluindo o carcinoma urotelial de primeira qualidade da pilha (UCC) da bexiga e do cancro colorretal (CRC)1,2. Sobre a metade dos pacientes com o UCC músculo-invasor (MIUCC), apesar da terapia curativa para a doença clìnica-localizada, desenvolverá metástases e morre dentro de 5 anos. A CRC metastática é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer nos EUA.
Estima-se que 81.190 novos pacientes e 17.240 mortes específicas de câncer ocorram em 2018 nos Estados Unidos devido ao UCC da bexiga3,4. Enquanto os pacientes serão predominantemente (70%) presente com doença invasiva não-muscular, 30% terão MIUCC5. Apesar da terapia curativa (Cistectomia Radical [RC] com ou sem quimioterapia sistemática) para a doença clìnica localizada, a metade dos pacientes com miucc da bexiga ainda desenvolverá metástases e morre dentro de 5 anos3. O acometimento linfonodal é encontrado em aproximadamente 20% − 25% dos pacientes submetidos a RC6,7,8. A taxa de sobrevida de cinco anos em pacientes positivos de LN é inferior a 35% mesmo após RC, sugerindo envolvimento do LN como preditor negativo crucial para o prognóstico em pacientes com UCC.
O cancro colorectal é o terceiro cancro o mais comum diagnosticado em homens e em mulheres nos Estados Unidos. Os resultados pacientes dependem pela maior parte das características do tumor e do microambiente do tumor, tais como a profundidade da invasão, o envolvimento de LN, e metástases distantes do órgão. Embora a taxa de mortalidade na CRC tenha diminuído na última década devido à triagem e cirurgias efetivas, estima-se que quase 50% dos pacientes com CRC desenvolvam metástases ou doença recorrente9.
Os modelos animais pequenos fornecem uma plataforma expedita, reprodutível, e modificável para estudar a progressão do tumor e testes padrões metastáticos diferentes. Não há atualmente nenhum modelo descrito do xenograft que imitam consistentemente a metástase de CRC e de UCC considerada nos pacientes. A rota preliminar da metástase distante do cancro é através da propagação linfática. A pesquisa nova sugere que os LNs forneçam tumores com um microambiente original, e são não somente alvos estacionários simplesmente onde as pilhas cancerosas passam transientemente, mas igualmente jogam um papel integral interagindo com as pilhas de cancro no processo metastático. De fato, nossos estudos descobriram que, além de educar e promover a progressão e metástases tumorais, o microambiente do LN stromal também é responsável pela resistência a fármacos em CRC10,11. Nosso laboratório confirmou recentemente os efeitos tumorigênico de ln pilhas stromal (lnscs) em CRC e em UCCs usando os modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do rato do xenograft (pdox)12,13.
O desenvolvimento de modelos pdox fornece uma importante plataforma para a pesquisa translacional do câncer14,15. Mantendo as principais características histológicas e genéticas de seu tumor doador, os modelos pdox permanecem estáveis em passagens e fazem boas plataformas para a pesquisa translacional do câncer12,13. Os modelos PDOX estão sendo usados para avaliação de medicamentos pré-clínicos, identificação de biomarcadores e avaliação pré-clínica de estratégias de medicina personalizada, permitindo a predição de desfechos clínicos. Atualmente, não há modelos de xenoenxertos descritos que considerem a importância do envolvimento do LN e sejam capazes de reproduzir consistentemente o tumor primário e a metástase de órgãos distantes na CRC e na UCC. Neste estudo, nós descrevemos o desenvolvimento de modelos de PDOX em ratos de NOD/SCID com reprodução de doenças metastáticas de CRC e de UCC com participação de LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
A doença metastática é responsável para a maioria de mortalidades pacientes do cancro. Em testes terapêuticos pré-clínicos, é crucial estabelecer modelos do rato que mais pròxima emular o crescimento humano do tumor com metástases distantes espontâneas do órgão. Usando modelos murinos com células cancerosas derivadas do tumor paciente implantado (xenoenxertos) permite uma melhor compreensão da biologia tumoral e biomarcadores preditivos, bem como testes e predição de efeitos antineoplásicos de novas ter…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller e Shannon McChesney, que ajudaram a iniciar esses estudos por seu excelente suporte técnico. Os autores também agradecem a Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar e Maria Latsis por assistência em pacientes que consentem e que fornecem espécimes tumorais.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
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