Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online
Summary
Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l’espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.
Abstract
Nell’optogenetica dei primati non umani (NHP), infettare grandi aree corticali con vettori virali è spesso un compito difficile e dispendioso in termini di tempo. Qui, dimostriamo l’uso di risonanza magnetica (MR) convezione avanzata consegna (CED) di vettori virali optogenetici in cortici somatosensoriali primari (S1) e motori (M1) di macachi per ottenere un’espressione corticale efficiente e diffusa di canali ionici sensibili alla luce. I vettori virali associati ad adeno (AAV) che codificano l’opsin C1V1 con spostamento rosso sono stati iniettati nella corteccia dei macachi rhesus sotto il CED guidato dalla RM. Tre mesi dopo l’infusione, l’imaging epifluorescente ha confermato ampie regioni di espressione optogenetica (>130 mm2) in M1 e S1 in due macachi. Inoltre, siamo stati in grado di registrare risposte elettrofisiologiche affidabili evocate dalla luce dalle aree che esprimono utilizzando array microelettrocorticografici. L’analisi istologica successiva e l’immunostaining contro il reporter hanno rivelato un’espressione optogenetica diffusa e densa in M1 e S1 corrispondente alla distribuzione indicata dall’imaging epifluorescente. Questa tecnica ci permette di ottenere l’espressione su vaste aree della corteccia entro un periodo di tempo più breve con danni minimi rispetto alle tecniche tradizionali e può essere un approccio ottimale per la consegna virale optogenetica in animali di grandi dimensioni come gli NNP. Questo approccio dimostra un grande potenziale per la manipolazione a livello di rete dei circuiti neurali con specificità di tipo cellulare nei modelli animali evolutivamente vicini agli esseri umani.
Introduction
L’optogenetica è un potente strumento che consente la manipolazione dell’attività neurale e lo studio delle connessioni di rete nel cervello. L’implementazione di questa tecnica nei primati non umani (NHP) ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione del calcolo neurale su larga scala, cognizione, e il comportamento nel cervello dei primati. Sebbene l’optogenetica sia stata implementata con successo negli NFP negli ultimi anni1,2,3,4,5,6,7, una sfida che ricercatori faccia sta raggiungendo alti livelli di espressione in grandi aree del cervello in questi animali. Qui, stiamo fornendo un approccio efficiente e semplificato per raggiungere alti livelli di espressione optogenetica in vaste aree della corteccia nei macachi. Questa tecnica ha un grande potenziale per migliorare gli studi optogenetici attuali in questi animali in combinazione con la registrazione all’avanguardia8,9 e stimolazione ottica10 tecnologie.
La convezione avanzata Delivery (CED) è un metodo consolidato di consegna di agenti farmacologici e altre grandi molecole, tra cui vettori virali, al sistema nervoso centrale11,12,13. Mentre i metodi di consegna convenzionali comportano infusioni multiple a basso volume distribuite tra piccole regioni del cervello, il CED può ottenere una distribuzione più ampia e uniforme degli agenti con meno infusioni. La convezione (convezione) di fluido sfuso guidato dalla pressione durante l’infusione consente una trasduzione più ampia e uniforme del tessuto bersaglio quando si forniscono vettori virali con CED. In studi recenti, abbiamo dimostrato la trasduzione e la successiva espressione optogenetica di ampie aree del motore primario (M1) e somatosensoriale (S1) cortices9 e talamo14 utilizzando la risonanza magnetica (MR) guidato CED.
Qui, illustreremo l’uso del CED per ottenere l’espressione optogenetica in grandi aree corticali con solo poche iniezioni corticali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo una tecnica fattibile ed efficiente per ottenere espressione optogenetica su larga scala nella corteccia somatosensoriale e motoria di NHP da CED guidata da MR. L’uso del CED a guida MR presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali di infusione virale nel cervello NHP. Uno di questi vantaggi è la capacità di raggiungere l’espressione su grandi aree con meno infusioni richieste. Ad esempio, con i metodi convenzionali, iniezioni multiple di 1-2 L dell’espressione di rendimento vettorial…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato dell’American Heart Association (AY), dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dalla Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e dall’UCSF Neuroscience Imaging Center. Questo lavoro è stato sostenuto anche dall’Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development dei National Institutes of Health sotto il premio Numero K12HD073945, il Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e il Center for Neurotechnology (CNT, un National Science Foundation Engineering Research Center sotto Grant EEC-1028725). Ringraziamo Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews per il loro aiuto con gli esperimenti e Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun per l’aiuto tecnico.
Materials
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
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