Brug af in vivo single-fiber optagelse og intakt dorsale root ganglion med vedhæftet Sciatic nerve at undersøge mekanismen for lednings svigt
Summary
Single-fiber optagelse er en effektiv elektrofysiologisk teknik, der gælder for de centrale og perifere nervesystemer. Sammen med forberedelsen af intakt DRG med vedlagte iskiasnerven nerve, er mekanismen for lednings svigt undersøgt. Begge protokoller forbedre forståelsen af det perifere nervesystem forhold med smerte.
Abstract
Single-fiber optagelse har været en klassisk og effektiv elektrofysiologisk teknik i løbet af de sidste par årtier på grund af sin specifikke anvendelse for nervefibre i det centrale og perifere nervesystem. Denne metode er især gældende for dorsale root basale ganglier (DRG), som er primære sensoriske neuroner, der udviser en pseudo-unipolær struktur af nerve processer. De mønstre og funktioner i handlings potentialerne bestået langs axoner er skrivbar i disse neuroner. Den nuværende undersøgelse anvender in vivo single-fiber optagelser til at observere lednings svigt af sciatiske nerver i komplet Freunds adjuverende (CFA)-behandlede rotter. Da den underliggende mekanisme ikke kan undersøgt ved hjælp in vivo single-fiber optagelser, patch-clamp-optagelser af DRG neuroner udføres på præparater af intakt DRG med vedlagte iskiasnerven nerve. Disse optagelser afslører en positiv korrelation mellem lednings svigt og den stigende hældning af efter-hyperpolariserings potentialet (AHP) af DRG neuroner i CFA-behandlede dyr. Protokollen for in vivo single fiber-optagelser tillader klassifikation af nervefibre via måling af lednings hastighed og overvågning af unormale forhold i nervefibrene i visse sygdomme. Intakt DRG med påsat perifer nerve giver observation af aktiviteten af DRG neuroner i de fleste fysiologiske forhold. Endegyldigt, single-fiber optagelse kombineret med elektrofysiologisk optagelse af intakte DRG er en effektiv metode til at undersøge rollen som lednings svigt under den analgetiske proces.
Introduction
Den normale overførsel af information langs nervefibre garanterer den normale funktion af nervesystemet. Unormal funktion af nervesystemet afspejles også i den elektriske signaltransmission af nervefibre. For eksempel, graden af demyelinering i centrale demyelinering læsioner kan klassificeres via sammenligning af ændringer i nerveledning hastighed før og efter intervention ansøgning1. Det er svært at intracellulært registrere nervefibre, undtagen i særlige præparater såsom Squid Giant Axon2. Derfor kan elektrofysiologisk aktivitet kun optages via den ekstracellulære optagelse af enkeltfibre. Som en af de klassiske elektrofysiologiske metoder, single-fiber optagelse har en længere historie end andre teknikker. Men, færre elektro fysiologer fatte denne metode på trods af sin omfattende anvendelse. Derfor er en detaljeret introduktion af standardprotokollen for single-fiber optagelse nødvendig for sin passende anvendelse.
Selv om forskellige patch-clamp teknikker har domineret moderne elektrofysiologisk undersøgelse, single-fiber optagelse stadig spiller en uerstattelig rolle i registrering af aktiviteter af nervefibre, især fibre sende perifer fornemmelse med deres sensorisk celle legeme placeret i dorsalrodsganglion (DRG). Fordelen ved at bruge Single-fiber optagelse her er, at in vivo fiber optagelse giver en lang observationsperiode med kapacitet til at registrere reaktioner på naturlige stimuli i prækliniske modeller uden forstyrrelse af det intracellulære miljø3 , 4.
Et stigende antal undersøgelser i løbet af de sidste to årtier har undersøgt komplekse funktioner langs nervefibre5, og lednings svigt, som er defineret som en tilstand af mislykket nerve impuls transmission langs Axon, var til stede i mange forskellige perifere nerver6,7. Tilstedeværelsen af lednings svigt i vores undersøgelse tjente som en iboende selv hæmmende mekanisme til graduering af vedvarende nociceptive input langs C-fibre8. Denne lednings svigt blev signifikant svækket under forhold med hyperalgesi4,9. Derfor, målretning de faktorer, der er involveret i lednings svigt kan repræsentere en ny behandling for neuropatiske smerter. For at observere lednings svigt skal affyrings mønsteret registreres og analyseres på grundlag af sekventielt afladede pigge baseret på single-fiber optagelse.
For grundigt at forstå mekanismen af lednings svigt, er det nødvendigt at identificere transmissions egenskaberne af Axon, eller mere præcist, membran egenskaberne af DRG neuroner, baseret på deres pseudo-unipolar anatomiske egenskaber. Mange tidligere undersøgelser på dette område er blevet udført på dissocierede DRG neuroner10,11, hvilket måske ikke er muligt for undersøgelsen af lednings svigt på grund af to forhindringer. For det første anvendes forskellige mekaniske og kemiske metoder i dissociations processen til gratis DRG neuroner, hvilket kan resultere i usunde celler eller ændre fænotype/egenskaber af neuronerne og forvirre resultaterne. For det andet, de vedlagte perifere nerver er dybest set fjernet, og lednings svigt fænomener er ikke observerbare i disse præparater. Derfor er et præparat af intakt DRG neuroner med en vedhæftet nerve blevet forbedret for at undgå de ovennævnte forhindringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om nylige undersøgelser har opnået calcium-billeddannelse af DRG-neuroner i vivo16, er det fortsat yderst udfordrende at udføre in vivo patch-clamp-optagelse fra individuelle DRG-nociceptorer. Derfor, en in vivo single-fiber tilgang til smerte feltet er af fortsat betydning. Single-fiber optagelse i denne protokol tillader objektiv observation af lednings svigt fænomener, og kombinationen af denne teknik med ex vivo præparat udviklet i den nuværende undersøgelse giver mulighed for unde…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Natural Science Foundation i Kina (31671089 og 81470060) og Shaanxi Provincial social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neurosciences. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neurosciences. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
