Utilisation de l'enregistrement in vivo à fibre unique et du ganglion de racine dorsal intact avec le nerf sciatique attaché pour examiner le mécanisme de l'échec de conduction
Summary
L’enregistrement à fibre unique est une technique électrophysiologique efficace qui s’applique aux systèmes nerveux central et périphérique. Avec la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché, le mécanisme de l’échec de conduction est examiné. Les deux protocoles améliorent la compréhension de la relation du système nerveux périphérique avec la douleur.
Abstract
L’enregistrement à fibre unique a été une technique électrophysiologique classique et efficace au cours des dernières décennies en raison de son application spécifique pour les fibres nerveuses dans les systèmes nerveux central et périphérique. Cette méthode est particulièrement applicable aux ganglions de racines dorsales (DRG), qui sont des neurones sensoriels primaires qui présentent une structure pseudo-unipolaire des processus nerveux. Les modèles et les caractéristiques des potentiels d’action transmis le long des axones sont enregistrés dans ces neurones. La présente étude utilise des enregistrements in vivo à fibre unique pour observer l’échec de conduction des nerfs sciatiques chez les rats traités par Freund (CFA) traités par Freund’s adjuvant complet (CFA). Comme le mécanisme sous-jacent ne peut pas être étudié à l’aide d’enregistrements in vivo à fibre unique, les enregistrements patch-clamp des neurones DRG sont effectués sur les préparations de DRG intact avec le nerf sciatique attaché. Ces enregistrements révèlent une corrélation positive entre l’échec de conduction et la pente montante du potentiel d’après-hyperpolarisation (AHP) des neurones dRG chez les animaux TRAITÉS par CFA. Le protocole pour les enregistrements in vivo de fibres uniques permet la classification des fibres nerveuses par la mesure de la vitesse de conduction et la surveillance des conditions anormales dans les fibres nerveuses dans certaines maladies. DRG intact avec le nerf périphérique attaché permet l’observation de l’activité des neurones de DRG dans la plupart des conditions physiologiques. De façon concluante, l’enregistrement à fibre unique combiné à l’enregistrement électrophysiologique de DrGs intacts est une méthode efficace pour examiner le rôle de l’échec de conduction pendant le processus analgésique.
Introduction
La transmission normale de l’information le long des fibres nerveuses garantit la fonction normale du système nerveux. Le fonctionnement anormal du système nerveux se reflète également dans la transmission du signal électrique des fibres nerveuses. Par exemple, le degré de démyélinisation dans les lésions centrales de démyélinisation peutêtre classifié par comparaison des changements dans la vitesse de conduction de nerf avant et après application d’intervention 1. Il est difficile d’enregistrer intracellulairement les fibres nerveuses, sauf dans les préparations spéciales telles que l’axone géant de calmar2. Par conséquent, l’activité électrophysiologique n’est enregistrable que par l’enregistrement extracellulaire de fibres uniques. Comme l’une des méthodes électrophysiologiques classiques, l’enregistrement à fibre unique a une histoire plus longue que d’autres techniques. Cependant, moins d’électrophysiologistes saisissent cette méthode en dépit de son application étendue. Par conséquent, une introduction détaillée du protocole standard pour l’enregistrement à fibre unique est nécessaire pour son application appropriée.
Bien que diverses techniques de patch-clamp aient dominé l’étude électrophysiologique moderne, l’enregistrement d’une seule fibre joue toujours un rôle irremplaçable en enregistrant les activités des fibres nerveuses, en particulier les fibres transmettant la sensation périphérique avec leur corps cellulaire sensoriel situé dans le ganglion de racine dorsal (DRG). L’avantage d’utiliser l’enregistrement à fibre unique ici est que l’enregistrement in vivo de fibre fournit un long temps d’observation avec la capacité d’enregistrer des réponses aux stimulus normaux dans les modèles précliniques sans perturbation de l’environnement intracellulaire3 , 4.
Un nombre croissant d’études au cours des deux dernières décennies a examiné des fonctions complexes le long des fibres nerveuses5, et l’échec de conduction, qui est défini comme un état de transmission infructueuse d’impulsion nerveuse le long de l’axone, était présent dans beaucoup de différents différents nerfs périphériques6,7. La présence de l’échec de conduction dans notre enquête a servi de mécanisme intrinsèque d’auto-inhibiteur pour la modulation de l’entrée nociceptive persistante le long des c-fibres8. Cette défaillance de conduction a été significativement atténuée dans des conditions d’hyperalgésie4,9. Par conséquent, le ciblage des facteurs impliqués dans l’échec de conduction peut représenter un nouveau traitement pour la douleur neuropathique. Pour observer la défaillance de conduction, le modèle de tir doit être enregistré et analysé sur la base des pointes séquentiellement déchargées basées sur l’enregistrement d’une seule fibre.
Pour bien comprendre le mécanisme de l’échec de conduction, il est nécessaire d’identifier les propriétés de transmission de l’axone, ou plus précisément, les propriétés membranaires des neurones DRG, en fonction de leurs propriétés anatomiques pseudo-unipolaires. Beaucoup d’études précédentes dans ce domaine ont été exécutées sur les neurones dissociés de DRG10,11, qui peuvent ne pas être faisables pour l’étude de l’échec de conduction dû à deux obstacles. Tout d’abord, diverses méthodes mécaniques et chimiques sont utilisées dans le processus de dissociation pour libérer les neurones DRG, ce qui peut entraîner des cellules malsaines ou modifier le phénotype / propriétés des neurones et confondre les résultats. Deuxièmement, les nerfs périphériques attachés sont fondamentalement enlevés, et les phénomènes de défaillance de conduction ne sont pas observables dans ces préparations. Par conséquent, une préparation des neurones dRG intacts avec un nerf attaché a été améliorée pour éviter les obstacles mentionnés ci-dessus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que des études récentes aient atteint l’imagerie calcique des neurones de DRG in vivo16,l’exécution in vivo de l’enregistrement de patch-clamp des nocicepteurs individuels de DRG demeure extrêmement provocante. Par conséquent, une approche in vivo à fibre unique pour le champ de la douleur est d’une importance continue. L’enregistrement à fibre unique dans le protocole actuel permet l’observation objective des phénomènes d’échec de conduction, et la combinaison de cette technique av…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par le financement de la National Natural Science Foundation of China (31671089 et 81470060) et du Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
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