विवो सिंगल-फाइबर रिकॉर्डिंग और अक्षत डोर्सल रूट गुच्छिका में संलग्न Sciatic तंत्रिका के साथ का उपयोग आचार विफलता के तंत्र की जांच करने के लिए
Summary
एकल फाइबर रिकॉर्डिंग एक प्रभावी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तकनीक है जो केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र पर लागू होती है। संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी के साथ, चालन विफलता के तंत्र की जांच की है. दोनों प्रोटोकॉल दर्द के साथ परिधीय तंत्रिका तंत्र के रिश्ते की समझ में सुधार.
Abstract
एकल फाइबर रिकॉर्डिंग केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में तंत्रिका फाइबर के लिए अपने विशिष्ट आवेदन की वजह से पिछले कुछ दशकों में एक शास्त्रीय और प्रभावी electrophysiological तकनीक किया गया है. इस विधि पृष्ठीय जड़ Ganglia (डीआरजी) के लिए विशेष रूप से लागू है, जो प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स कि तंत्रिका प्रक्रियाओं के एक छद्म-एकध्रुवीय संरचना प्रदर्शन कर रहे हैं. पैटर्न और axons के साथ पारित कार्रवाई क्षमता की सुविधाओं इन न्यूरॉन्स में रिकॉर्ड कर रहे हैं. वर्तमान अध्ययन में विवो एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में उपयोग करता है पूरा फ्रेंड के सहायक (CFA) इलाज चूहों में sciatic नसों के चालन विफलता का निरीक्षण करने के लिए. अंतर्निहित तंत्र vivo एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता है के रूप में, DRG न्यूरॉन्स के पैच-क्लैम्प-रिकॉर्डिंग संलग्न sciatic तंत्रिका के साथ बरकरार DRG की तैयारी पर प्रदर्शन कर रहे हैं. इन रिकॉर्डिंग चालकीय विफलता और सीएफए इलाज जानवरों में DRG न्यूरॉन्स के बाद hyperpolarization क्षमता (AHP) की बढ़ती ढलान के बीच एक सकारात्मक संबंध प्रकट करते हैं. विवो एकल फाइबर-रिकॉर्डिंग के लिए प्रोटोकॉल चालन वेग की माप और कुछ रोगों में तंत्रिका फाइबर में असामान्य स्थितियों की निगरानी के माध्यम से तंत्रिका फाइबर के वर्गीकरण की अनुमति देता है। संलग्न परिधीय तंत्रिका के साथ बरकरार DRG सबसे शारीरिक स्थितियों में डीआरजी न्यूरॉन्स की गतिविधि के अवलोकन की अनुमति देता है. निर्णायक रूप से, बरकरार DRGs के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ संयुक्त एकल फाइबर रिकॉर्डिंग एनाल्जेसिक प्रक्रिया के दौरान चालन विफलता की भूमिका की जांच करने के लिए एक प्रभावी तरीका है।
Introduction
तंत्रिका फाइबर के साथ जानकारी के सामान्य संचरण तंत्रिका तंत्र के सामान्य समारोह की गारंटी देता है. तंत्रिका तंत्र की असामान्य कार्यप्रणाली तंत्रिका फाइबर के विद्युत संकेत संचरण में भी परिलक्षित होती है। उदाहरण के लिए, केंद्रीय demyelination घावों में demyelination की डिग्री से पहले और हस्तक्षेप आवेदन1के बाद तंत्रिका चालन वेग में परिवर्तन की तुलना के माध्यम से वर्गीकृत किया जा सकता है. यह इस तरह के स्क्विड विशाल एक्सॉन2के रूप में विशेष तैयारी में छोड़कर, तंत्रिका फाइबर रिकॉर्ड करने के लिए intracellularly मुश्किल है। इसलिए, electrophysiological गतिविधि केवल एकल फाइबर के extracellular रिकॉर्डिंग के माध्यम से रिकॉर्ड करने योग्य है. शास्त्रीय electrophysiological तरीकों में से एक के रूप में, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग अन्य तकनीकों की तुलना में एक लंबा इतिहास है. हालांकि, कम electrophysiologists अपने व्यापक आवेदन के बावजूद इस विधि को समझ. इसलिए, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए मानक प्रोटोकॉल की एक विस्तृत परिचय अपने उपयुक्त आवेदन के लिए आवश्यक है.
हालांकि विभिन्न पैच-क्लैम्प तकनीक आधुनिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन का प्रभुत्व है, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग अभी भी तंत्रिका फाइबर की गतिविधियों की रिकॉर्डिंग में एक अपूरणीय भूमिका निभाता है, विशेष रूप से फाइबर उनके साथ परिधीय सनसनी संचारण पृष्ठीय मूल गुच्छिका (डीआरजी) में स्थित संवेदी कोशिका शरीर। यहाँ एकल फाइबर रिकॉर्डिंग का उपयोग करने का लाभ यह है कि विवो फाइबर रिकॉर्डिंग में क्षमता के साथ एक लंबे अवलोकन समय प्रदान करता है intracellular पर्यावरण की अशांति के बिना पूर्व नैदानिक मॉडल में प्राकृतिक उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए3 , 4.
पिछले दो दशकों में अध्ययन की बढ़ती संख्या तंत्रिका फाइबर के साथ जटिल कार्यों की जांच की है5, और चालन विफलता, जो एक्सॉन के साथ असफल तंत्रिका आवेग संचरण के एक राज्य के रूप में परिभाषित किया गया है, कई अलग अलग में मौजूद था परिधीय तंत्रिकाएं6,7. हमारी जांच में चालन विफलता की उपस्थिति सी फाइबर8के साथ लगातार nociceptive इनपुट के मॉडुलन के लिए एक आंतरिक आत्म निरोधी तंत्र के रूप में कार्य किया। इस चालन विफलता को हाइपरएल्गेसिया4,9की परिस्थितियों में काफी कम किया गया था . इसलिए, चालन विफलता में शामिल कारकों को लक्षित neuropathic दर्द के लिए एक नया इलाज का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. चालन विफलता का निरीक्षण करने के लिए, फायरिंग पैटर्न दर्ज किया जाना चाहिए और क्रमिक रूप से छुट्टी spikes एकल फाइबर रिकॉर्डिंग के आधार पर के आधार पर विश्लेषण किया जाना चाहिए।
चालकीय ताने-पालन विफलता के तंत्र को अच्छी तरह से समझने के लिए, एक्सॉन के संचरण गुणों की पहचान करना आवश्यक है, या अधिक ठीक, डीआरजी न्यूरॉन्स की झिल्ली गुण, उनके छद्म-एकध्रुवीय शारीरिक गुणों के आधार पर। इस क्षेत्र में कई पिछले अध्ययन अलग DRG न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया गया है10,11, जो दो बाधाओं के कारण चालन विफलता की जांच के लिए संभव नहीं हो सकता है. सबसे पहले, विभिन्न यांत्रिक और रासायनिक तरीकों वितरण प्रक्रिया में उपयोग किया जाता है DRG न्यूरॉन्स मुक्त करने के लिए, जो अस्वास्थ्यकर कोशिकाओं में परिणाम या न्यूरॉन्स के phenotype / गुण में परिवर्तन और निष्कर्षों को भ्रमित कर सकते हैं. दूसरा, संलग्न परिधीय नसों मूल रूप से हटा रहे हैं, और चालन विफलता घटना इन तैयारियों में प्रेक्षणीय नहीं हैं. इसलिए, एक संलग्न तंत्रिका के साथ बरकरार DRG न्यूरॉन्स की तैयारी के लिए उपर्युक्त बाधाओं से बचने में सुधार किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि हाल के अध्ययनों से विवो16में DRG न्यूरॉन्स के कैल्शियम इमेजिंग हासिल की है, व्यक्तिगत DRG nociceptors से vivo पैच-क्लैम्प रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन बेहद चुनौतीपूर्ण बनी हुई है. इसलिए, दर्द के क्षेत्र ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31671089 और 81470060) और Shaanxi प्रांतीय सामाजिक विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान परियोजना (2016SF-250) से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
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