インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる
1Department of Neurobiology, School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, 2Department of Toxicology, School of Public Health,ShanXi Medical University, 3Department of Psychology,Fourth Military Medical University, 4Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Advanced Innovation Center for Human Brain Protection,Capital Medical University, 5Neuroscience Research Institute, Key Lab for Neuroscience, Ministry of Education/National Health Commission,Peking University, 6Department of Radiation Biology, Faculty of Preventive Medicine,Fourth Military Medical University
Summary
シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.
Abstract
シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系の神経線維に対する特定の用途のために、過去数十年にわたって古典的で効果的な電気生理学的手法となっています。この方法は、神経プロセスの擬似単極構造を示す一次感覚ニューロンである背面根神経節(DRG)に特に適用可能である。軸に沿って渡される作用電位のパターンと特徴は、これらのニューロンで記録可能です。本研究では、生体内単繊維記録を用い、完全なフロイントのアジュバント(CFA)処理ラットにおける坐骨神経の伝導障害を観察する。生体内の単一繊維記録では基礎となるメカニズムを研究できないため、DRGニューロンのパッチクランプ記録は、付着した坐糸神経を有する無傷のDRGの調製に対して行われる。これらの記録は、CFA処理動物におけるDRGニューロンの伝導障害と高偏波後(AHP)の上昇勾配との間に正の相関関係を明らかにする。生体内単一繊維記録のためのプロトコルは、伝導速度の測定と特定の疾患における神経線維の異常な状態の監視を介して神経線維の分類を可能にします。付着した末梢神経を有する無傷のDRGは、ほとんどの生理学的条件におけるDRGニューロンの活性の観察を可能にする。結論として、無傷のDRGの電気生理学的記録と組み合わせた単一繊維記録は、鎮痛プロセス中の伝導不全の役割を調べる効果的な方法である。
Introduction
神経線維に沿った情報の正常な伝達は、神経系の正常な機能を保証します。神経系の異常な機能は、神経線維の電気信号伝達にも反映される。例えば、中枢脱髄病変における脱髄の程度は、介入適用1の前後の神経伝導速度の変化の比較を介して分類することができる。イカの巨大軸線2などの特別な調製物を除いて、細胞内で神経線維を記録することは困難である。したがって、電気生理学的活性は、単一繊維の細胞外記録によってのみ記録可能である。古典的な電気生理学的方法の一つとして、単一繊維記録は他の技術よりも長い歴史を有する。しかし、その広範な応用にもかかわらず、この方法を把握する電気生理学者は少ない。したがって、その適切なアプリケーションには、シングルファイバ記録のための標準プロトコルの詳細な導入が必要です。
様々なパッチクランプ技術が現代の電気生理学的研究を支配しているが、単一繊維記録は神経線維、特に末梢感覚を伝達する繊維の活動を記録する上で依然としてかけがえのない役割を果たしている。背面根神経節(DRG)に位置する感覚細胞体。ここでシングルファイバー記録を使用する利点は、生体内繊維記録において、細胞内環境の乱れなしに前臨床モデルにおける自然刺激に対する応答を記録する能力を有する長い観察時間を提供することです3,4.
過去20年間に増加した研究の数は、神経線維5に沿って複雑な機能を調べており、軸に沿って失敗した神経インパルス伝達の状態として定義される伝導障害は、多くの異なる存在であった末梢神経6,7.我々の調査における伝導障害の存在は、C繊維8に沿った持続的な受感覚的入力の変調のための本質的な自己阻害機構として役立った。この伝導障害は、過敏症4,9の条件下で有意に減衰した。したがって、伝導不全に関与する因子を標的化することは、神経因性疼痛に対する新たな治療法を表しうる。伝導不良を観察するには、単一繊維記録に基づいて順次排出されたスパイクに基づいて焼成パターンを記録し、分析する必要があります。
伝導不良のメカニズムを完全に理解するためには、擬似単極解剖特性に基づいて、軸方向の透過特性、またはより正確にはDRGニューロンの膜特性を同定する必要があります。この分野における多くの以前の研究は、解離されたDRGニューロン10,11に対して行われており、これは2つの障害による伝導不良の調査では不可能でありかねない。第一に、DRGニューロンを解放する解離プロセスでは、様々な機械的および化学的方法が使用され、不健康な細胞を生み出したり、ニューロンの表現型/特性を変化させたり、その結果を混乱させる可能性があります。第二に、取り付けられた末梢神経は基本的に除去され、伝導不全現象はこれらの調製物では観察できない。従って、前述の障害を避けるために、付着した神経を有する無傷のDRGニューロンの調製が改善された。
Protocol
現在のプロトコルは、米国公衆衛生サービスの人道的ケアと実験動物の使用に関する方針に従い、第4軍事医科大学の動物実験倫理委員会は、プロトコルを承認しました。 1. 動物 24匹のスプラーグ・ドーリーラット(生後4~8週齢)を2つのグループに分けます。生理生殖量で14匹のラットと10匹のラットの別のグループでCFAの100 μLのプランター注射によって完全なフロ?…
Representative Results
シングルファイバ記録プロトコルの結果は、繊維解剖の品質に依存します。生体内実験のための動物は、簡単な解剖のために神経幹を健康に保つために良い状況でなければなりません(議論セクションのアドバイスを参照してください)。多くの場合、繊維上での薬物送達には薬物塗布浴が必要です。図1は、インビボシングルファイバー記録がどのように操作されたかを示し(<strong…
Discussion
最近の研究では、生体内16におけるDRGニューロンのカルシウムイメージングを達成しているが、個々のDRGノシセプターからの生体内パッチクランプ記録の実行は非常に困難なままである。したがって、疼痛分野に対する生体内単一繊維アプローチは、継続的に重要である。本プロトコルにおける単一繊維記録は、伝導故障現象の客観的な観察を可能にし、本手法と現行の研?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(31671089および81470060)と浙西省社会開発科学技術研究プロジェクト(2016SF-250)からの資金援助によって支援されました。
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
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Citer Cet Article
Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).