Bruk av in vivo single-fiber Recording og intakt rygg rot Ganglion med vedlagt ischias nerven til å undersøke mekanismen for Lednings feil

Summary

Single-fiber opptak er en effektiv elektrofysiologisk teknikk som gjelder for den sentrale og perifere nervesystemet. Sammen med utarbeidelse av intakt DRG med vedlagte ischias nerven, er mekanismen for Lednings svikt undersøkt. Begge protokollene forbedre forståelsen av perifere nervesystemet forhold til smerte.

Abstract

Single-fiber innspillingen har vært en klassisk og effektiv elektrofysiologisk teknikk de siste ti årene på grunn av sin spesifikke anvendelse for nervefibre i den sentrale og perifere nervesystemet. Denne metoden er spesielt anvendelig på rygg rot ganglia (DRG), som er primære sensoriske neurons som viser en pseudo-Unipolare struktur av nervøse prosesser. Mønstrene og funksjonene i handlingen potensialer gått langs axons er skrivbar i disse neurons. Den nåværende studien bruker in vivo single-fiber innspillinger for å observere Lednings svikt av ischias nerver i fullstendig Freund ‘ s adjuvant (CFA)-behandlet rotter. Som den underliggende mekanismen ikke kan bli studert ved hjelp av in vivo single-fiber innspillinger, patch-Clamp-innspillinger av DRG neurons utføres på preparater av intakt DRG med vedlagte ischias nerven. Disse opptakene avslører en positiv korrelasjon mellom Lednings svikt og den stigende skråningen av hyperpolarization potensialet (AHP) av DRG neurons i CFA-behandlede dyr. Protokollen for in vivo single fiber-innspillinger gjør at klassifisering av nervefibre via måling av Lednings hastighet og overvåking av unormale forhold i nervefibre i visse sykdommer. Intakt DRG med vedlagt perifer nerve tillater observasjon av aktiviteten til DRG neurons i de fleste fysiologiske forhold. Endelig, Single-fiber opptak kombinert med elektrofysiologisk innspilling av intakt DRGs er en effektiv metode for å undersøke rollen til Lednings svikt under smertestillende prosess.

Introduction

Den normale overføring av informasjon langs nervefibre garanterer normal funksjon av nervesystemet. Unormal funksjon av nervesystemet er også reflektert i det elektriske signalet overføring av nervefibre. For eksempel kan graden av demyelinisering i sentrale demyelinisering lesjoner klassifiseres via sammenligning av endringer i nerve Lednings hastighet før og etter intervensjon søknad¹. Det er vanskelig å intracellulært posten nervefibre, bortsett fra i spesielle forberedelser som blekksprut gigantiske axon². Derfor er elektrofysiologisk aktivitet bare skrivbar via ekstracellulære innspilling av enkelt fibre. Som en av de klassiske elektrofysiologisk metoder, Single-fiber innspillingen har en lengre historie enn andre teknikker. Men færre electrophysiologists fatte denne metoden til tross for sin omfattende anvendelse. Derfor en detaljert innføring av standardprotokollen for single-fiber opptak er nødvendig for det aktuelle programmet.

Selv om ulike patch-Clamp teknikker har dominert moderne elektrofysiologisk studie, Single-fiber innspillingen fortsatt spiller en uerstattelig rolle i innspillingen av aktiviteter av nervefibre, spesielt fibre overfører perifere sensasjon med sine Sensorisk celle kroppen ligger i rygg rot Ganglion (DRG). Fordelen med å bruke single-fiber innspillingen her er at in vivo fiber innspillingen gir en lang observasjon tid med kapasitet til å registrere svar på naturlige stimuli i prekliniske modeller uten forstyrrelse av intracellulære miljø^{3 , fire}til.

Et økende antall studier de siste to ti årene har undersøkt komplekse funksjoner langs nervefibre⁵, og Lednings svikt, som er definert som en tilstand av mislykket nerve impuls overføring langs axon, var til stede i mange forskjellige perifere nerver^6,7. Tilstedeværelsen av Lednings svikt i etterforskningen vår tjente som en iboende selv hemmende mekanisme for modulering av vedvarende nociceptive innspill langs C-fibre⁸. Denne Lednings svikt ble betydelig svekket under forhold^{av hyperalgesia.} Derfor, rettet mot de faktorene som er involvert i Lednings svikt kan representere en ny behandling for nevropatisk smerte. For å observere Lednings svikt, skal skyte mønsteret bli registrert og analysert på grunnlag av sekvensielt utladet pigger basert på single-fiber opptak.

For å grundig forstå mekanismen for Lednings svikt, er det nødvendig å identifisere overførings egenskapene til axon, eller mer presist, membran egenskapene til DRG neurons, basert på deres pseudo-Unipolare Anatomiske egenskaper. Mange tidligere studier på dette feltet har blitt utført på dissosiert DRG neurons^10,11, som kanskje ikke er gjennomførbart for etterforskningen av Lednings svikt på grunn av to hindringer. Først er ulike mekaniske og kjemiske metoder som brukes i dissosiasjon prosessen til gratis DRG neurons, som kan resultere i usunne celler eller endre fenotype/egenskapene til neurons og forvirre funnene. For det andre, de vedlagte perifere nerver er i utgangspunktet fjernet, og Lednings svikt fenomener er ikke synlig i disse forberedelsene. Derfor har en forberedelse av intakt DRG neurons med en vedlagt nerve blitt forbedret for å unngå ovennevnte hindringer.

Protocol

Den nåværende protokollen fulgte guide for USA Public Health Service ‘ s policy på Human Care og bruk av laboratorium dyr, og komiteen for etikk Animal eksperimenter av den fjerde militære Medical University godkjent protokollen. 1. dyr Dividere 24 Sprague-Dawley rotter (4-8 ukens gamle) i to holdene. Tilvirke fullstendig Freund ‘ adjuvant (CFA) modell av intraplantar injeksjon av 100 μL av CFA inne ettall gruppe av 14 rotter og en annen gruppe av 10 rotter av handling med saltv…

Representative Results

Utfallet av single-fiber opptaks protokoll avhenger av kvaliteten på fiber disseksjon. Dyret for in vivo eksperimenter må være i en god situasjon for å holde nerve stammen frisk for enkel disseksjon (se råd i diskusjonen delen). Et medikament søknad bad er nødvendig i mange tilfeller for narkotika levering på fibre. Figur 1 illustrerer hvordan in vivo single-fiber innspillingen ble operert (figur 1a) og presenterer en klassisk innspilling fra ischias nerven av CFA-be…

Discussion

Selv om nyere studier har oppnådd kalsium Imaging av DRG neurons in vivo¹⁶, utfører in vivo patch-Clamp opptak fra individuelle DRG nociceptors fortsatt svært utfordrende. Derfor, en in vivo single-fiber tilnærming for smerten feltet er av fortsatt betydning. Single-fiber opptak i den nåværende protokollen tillater objektiv observasjon av Lednings svikt fenomener, og kombinasjonen av denne teknikken med ex vivo forberedelse utviklet i dagens studie tillater undersøkelse av underliggende mek…

Materials

Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier	Nihon kohden	MEZ-8201	Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor	ShangHai JiaLong Teaching instrument factory	SZF-1	Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system	CED	Spike-2	Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator	Narishige	SM-21	Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers	A.Dumont	5#	Separate the single fiber
Isolator	Nihon kohden	SS-220J
Memory oscilloscope	Nihon kohden	VC-9	Display recorded discharge during
			experiment
Stereomicroscope	ZEISS	SV-11	Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator	Nihon kohden	SEZ-7203	Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair	Stoelting accompany		Delivery of the mechanical stimuli
Water bath	Scientz biotechnology Co., Ltd.	SC-15	Heating paroline to maintain at 37oC
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier	Axon Instruments	Multiclamp 700B	Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table	Optical Technology Co., Ltd.		Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera	Olympus	TH4-200	See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex	Axon	Clampex 9.2	Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit	Axon	Clampfit 10.0	Software for data analysis
Electrode puller	Sutter	P-97	Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette	Sutter	BF 150-75-10
Micromanipulator	Sutter	MP225	Give a precise control of the microelectrode
Microscope	Olympus	BX51WI	Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin	Origin lab	Origin 8	Software for drawing picture
Perfusion Pump	BaoDing LanGe Co., Ltd.	BT100-1J	Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance	Sartorius	BS 124S	Weighing reagent
pH Modulator	Denver Instrument	UB7	Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Extracellular solution
Chloralose	Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.	M07752	Mixed solution for Anesthesia
Collagenase	Sigma-Aldrich	SLBQ1885V	Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Extracellular solution
Liquid Paraffin	TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.		Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Extracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911	Extracellular solution
Protease	Sigma-Aldrich	62H0351	Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5671	Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751	Extracellular solution
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Extracellular solution
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Mixed solution for Anesthesia