Использование In Vivo одноволоконной записи и Intact Dorsal Root Ganglion с прикрепленным седалиальным нервом для изучения механизма отказа от проводимости
Summary
Запись с одним волокном является эффективным электрофизиологическим методом, применимым к центральной и периферической нервной системе. Наряду с подготовкой нетронутой DRG с прикрепленным седаличным нерва, исследуется механизм отказа проводимости. Оба протокола улучшают понимание отношений периферической нервной системы с болью.
Abstract
Одноволоконная запись была классической и эффективной электрофизиологической техникой в течение последних нескольких десятилетий из-за его специфического применения нервных волокон в центральной и периферической нервной системе. Этот метод особенно применим к корням ганглиев (DRG), которые являются основными сенсорными нейронами, которые демонстрируют псевдо-однополярная структура нервных процессов. Шаблоны и особенности потенциалов действия, передаваемые вдоль аксонов, записываются в этих нейронах. Настоящее исследование использует in vivo одноволоконных записей для наблюдения за отказом проводимости седалищных нервов в адъювантных (CFA) в полном фрейундах. Поскольку основной механизм не может быть изучен с использованием in vivo одноволоконных записей, патч-зажим-записи нейронов DRG выполняются на препаратах нетронутыми DRG с прикрепленным седаличным нервом. Эти записи показывают положительную корреляцию между отказом проводимости и ростом склона после гиперполяризации потенциал (AHP) нейронов DRG в CFA-обработанных животных. Протокол для одноразовых волоконных записей in vivo позволяет классифицировать нервные волокна с помощью измерения скорости проводимости и мониторинга аномальных состояний в нервных волокнах при определенных заболеваниях. Intact DRG с прикрепленным периферическим нервом позволяет наблюдать за активностью нейронов DRG в большинстве физиологических условий. Окончательно, одноволоконная запись в сочетании с электрофизиологической записи нетронутых DRGs является эффективным методом для изучения роли проводки неудачи во время обезболиваного процесса.
Introduction
Нормальная передача информации по нервным волокнам гарантирует нормальную функцию нервной системы. Аномальное функционирование нервной системы также отражается в передаче электрического сигнала нервных волокон. Например, степень демиелинации при поражениях центральной демиелинации можно классифицировать путем сравненияизменений в скорости нервной проводимости до и после применения 1. Трудно внутриклеточного записи нервных волокон, за исключением специальных препаратов, таких как кальмар гигантский аксон2. Таким образом, электрофизиологическая активность записывается только через внеклеточную запись одиночных волокон. Как один из классических электрофизиологических методов, одноволоконная запись имеет более длинную историю, чем другие методы. Тем не менее, меньше электрофизиологов, хватая этот метод, несмотря на его широкое применение. Поэтому для его соответствующего применения необходимо детальное введение стандартного протокола для записи с одним волокном.
Хотя различные методы патч-зажим доминируют современные электрофизиологические исследования, одноволоконная запись по-прежнему играет незаменимую роль в записи деятельности нервных волокон, особенно волокон, передающих периферические ощущения с их сенсорное тело клетки, расположенное в терзаем корнях (DRG). Преимущество использования одноволоконной записи здесь заключается в том, что запись волокна in vivo обеспечивает длительное время наблюдения с возможностью записи реакций на естественные раздражители в доклинических моделях без нарушения внутриклеточной среды3 , 4.
Все большее число исследований за последние два десятилетия изучал сложные функции вдоль нервных волокон5, и проводящий отказ, который определяется как состояние неудачной передачи нервного импульса вдоль аксона, присутствовал во многих различных периферийные нервы6,7. Наличие сбоя проводимости в нашем исследовании служило внутреннеинтрозным самоингуляторным механизмом для модуляциистойких ноцицептивных входных вдоль C-волокон 8. Этот сбой проводимости был значительно ослаблен в условияхгипералгезии 4,9. Таким образом, ориентации факторов, участвующих в отказе проводимости может представлять собой новое лечение невропатической боли. Для наблюдения за сбоем в проводимости, схема стрельбы должна быть записана и проанализирована на основе последовательно разряженных шипов на основе одноволоконной записи.
Чтобы досконально понять механизм отказа проводимости, необходимо определить свойства передачи аксона, а точнее, мембранные свойства нейронов DRG, основанные на их псевдооднополярных анатомических свойствах. Многие предыдущие исследования в этой области были проведены на диссоциированных нейронов DRG10,11, которые не могут быть осуществимы для расследования отказа проводимости из-за двух препятствий. Во-первых, различные механические и химические методы используются в процессе диссоциации, чтобы освободить DRG нейронов, которые могут привести к нездоровым клеткам или изменить фенотип / свойства нейронов и заставить заставить себя свести на нет выводы. Во-вторых, прикрепленные периферийные нервы в основном удаляются, и явления протоиерой неудачи не прослеживаются в этих препаратах. Таким образом, подготовка нетронутых нейронов DRG с прикрепленным нервом была улучшена, чтобы избежать вышеупомянутых препятствий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя последние исследования достигли кальция изображения нейронов DRG in vivo16, выполняя in vivo патч-зажим записи от отдельных ноцицепторов DRG остается чрезвычайно сложной задачей. Таким образом, in vivo одноволокнистый подход для болевого поля имеет неотразимую важность. Одноволо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием со стороны Национального фонда естественных наук Китая (31671089 и 81470060) и Шэньси провинциального проекта по исследованию науки и технологий в области социального развития (2016SF-250).
Materials
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37oC |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neurosciences. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neurosciences. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
