인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델
Summary
타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.
Abstract
HiPSC에서 파생 된 세포를 사용 하 여 인간의 신경 퇴행 성 질환을 연구 하는 귀중 한 접근 방식을 나타냅니다. 여기, 우리는 환자와 파 킨 슨 병 (PD)으로 알파 synuclein 유전자 (SNCA) 로커 스의 triplication에서에서 파생 된 hiPSCs의 분화에 대 한 최적화 된 프로토콜을 설명-관련 dopaminergic 신경 인구. 증거를 축적으로 나타났습니다 SNCA 의 상부는 충족 SNCA 표현의 규제 대상으로 하는 특히 그 PD를 위한 소설 치료 접근을 설치할 필요가 PD. Recognizing의 개발에 대 한 원인이 되는 우리 최근 epigenetically SNCA intron 1 규제 지역에서 메 틸 화 수준의 풍요로운 여 SNCA 전사를 조절 하는 CRISPR/dCas9-DNA 메 틸 화-기반 시스템 개발. 죽은의 구성 된 시스템을 제공 (비활성화) 버전 Cas9의 DNA methyltransferase 효소 3A의 촉매 도메인 (dCas9) 융합 (DNMT3A), lentiviral 벡터 사용 됩니다. 이 시스템 SNCA 로커 스의 triplication와 셀에 적용 되 고 SNCAmRNA와 단백질 수준 SNCA intron 1의 타겟된 DNA 메 틸 화를 통해 약 30% 감소 시킨다. SNCA 레벨의 미세 downregulation 질환 관련 세포 고기를 구출 하 고 현재 프로토콜에서 우리 hiPSCs 신경 조상 세포 (Npc)와 설립 SNCA 에서 메 틸 프로필의 평가 대 한 pyrosequencing 분석 실험의 유효성 검사로 차별화에 대 한 단계별 절차를 설명 하고자 intron 1. 좀 더 자세하게에서이 실험에서 사용 된 lentivirus-CRISPR/dCas9 시스템 개요,이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, lentiviral 벡터를 집중 하 고 epigenome 게놈 편집 응용 프로그램을 사용 하 여 그들의 적합성을 강조 하는 방법을 hiPSCs 및 Npc입니다. 프로토콜은 쉽게 적응 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 높은 titer lentiviruses를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다.
Introduction
여러 epigenome 편집 플랫폼 최근 유전자 식1,2를 제어 하는 지역에서 어떤 DNA 시퀀스를 대상으로 개발 되었습니다. 만든된 epigenome 편집 도구는 (i) 전사 조절, (ii) 변경 posttranslational 히스톤 수정, (iii) 수정 DNA 메 틸 화, (iv) 규제 요소 상호 작용을 조절 하는 설계 되었습니다. 비활성화 (죽은) Cas9에 전사/chromatin 한정자를 접근 (dCas9) 발생 이전에서 아연 등 개발된 epigenome 편집 플랫폼, 단백질 (ZFPs) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 (이야기), 손가락 은닉 강력한 transcriptional 이펙터 도메인 (ED) 디자인 DNA 바인딩 도메인 (DBD)3융합. 활성화 또는 억제 등 원하는 표현 형의 결과 생 loci (그림 1)에 고정 효과 기 분자에 의해 정의 됩니다. 프로그래밍 가능한 transcriptional 활성 제를 만들려면 dCas9/gRNA 모듈은 VP164,,56 (그림 1A), 폴 II 및 일반 전사 기계 신병 바이러스 활성화 도메인에 연결 됩니다. 이 시스템의 수정 VP64, VP16 도메인의 tetramer 제공 하는 더욱 강력한 활성화 속도5,6을 포함 했다. 시스템은 발기인 및 규정 요소를 대상으로 코딩 noncoding 지역 활성화를 성공적으로 고용 되었다. 중요 한 것은, VP64 분자 대상 지역에 염색 질 구조를 직접 수정 하지 않습니다, 비록 그것은 chromatin 한정자 액티브 (euchromatin) 마크, H3/H4 acetylation와 H3-K4 디 등의 증 착에 결과 묶는 신병 / 트라이-메 틸 화5,6. VP64, 뿐만 아니라 인간의 NF κB 복잡 한 p65 소 단위 dCas9/gRNA 모듈7에 닿는 되었습니다. 흥미롭게도, 상류 녹음 방송 시작 위치 (TSSs)과 발기인 내의 지역에 이러한 이펙터의 tethering 강한 유전자 유도 결과. 그럼에도 불구 하 고, VP64 및 p65 이펙터 있으며 하류 TSSs의 원심 강화7,8시 지역에 연결 되는 동안 activatory 효과 발휘 또한 수 있습니다. 더 강력한 transcriptional 응답을 유도, 여러 dCas9 VP64 또는 dCas9-p65 융해 단일 대상 로커 스9,10에 채용 될 필요가 있다. 따라서, 다음-세대 활성 제, 노, 등 단일 dCas9 gRNA 복잡 한에 의해 여러 이펙터 도메인 모집의 최근 개발 귀착되는 강한 활성화 기능 비교 dCas9 VP64 융합 대응11 , 12. 향상 된 transcriptional 활성화 VP64, p65, 및 Rta (VPR), 감마-herpesviruses에서 dCas913 (그림 1A)의 C-말단의 transactivation 도메인의 융합을 통해 얻은 되었습니다. 유사한 CRISPR/dCas9 시스템 대상별 억압 (그림 1B)에 대 한 개발 되었습니다.
내 생 유전자 억압 메커니즘 (그림 1B)의 다양 한 설계 진압 융해와 함께 얻을 수 있습니다. CRISPR/dCas9 시스템, (effector 도메인/s), 없이 진압 DBD에 연결 된 유전자 발현 발기인 또는 업스트림/다운스트림-TSS 지역3,6 에 곁에 하는 동안 침묵 효율적으로 수 있습니다 입증 되었습니다. 14. 녹음 방송에 영향 전사 인자 바인딩 및 RNA 중 합 효소 처리의 입체 장애에 의해 발생 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 보다 포괄적인 접근 필요, 입체 방해 혼자 여 진 억압은 종종 강력한 입을 위한 충분 합니다. CRISPR/dCas9 시스템 transcriptional 진압 도메인 (TRDs), 히스톤 한정자를 기반으로 하는 달 았 죠의 다음 세대의 최근 개발 (H3-K9 디-/ 트라이-메 틸 화, H3 K27 디-/ 트라이-메 틸 화; H3-K36 디-/ 트라이-메 틸 화, H3/H4 deacetylation), 그리고 DNA (CpG) 메 틸 보다 강력한 효과4,5,,1516, 입을 수 있도록 하는 후 성적인 도구 건설에 17,18,,1920. 그것은 DNA에 이러한 epigenetic 한정자의 모집 일반적으로는 더 강력한 입을 결과21,22를 생성 하는 더 많은 폐쇄 하 고 압축 된 chromatin의 형성으로 이어질 수 있습니다 입증 되었습니다. DBDs와 함께 사용 하는 가장 일반적으로 입을 도메인 Krüppel 관련 상자 (리아)4,5입니다. 요인의 모집 chromatin 변경; 해당 입증 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 개조의 메커니즘은 아직 해명된16,,1718수 있습니다. 최근에, 그것은 보였다 DNA에 리아의 지역화가 이러한 상호 작용 중재의 형성 가능성을 제안 하는 히스톤 methyltransferase SETDB1 및 히스톤 deacetylation (HDAC) NuRD 단지의 어셈블리를 홍보할 수 있습니다. chromatin 응축 그리고 transcriptional 입을3,13. 다른 접근 방법으로 이펙터 도메인 사용자 지정 후 입을 단백질을 만드는 DBDs에 융합 수 있습니다. 이 시스템은 직접 억압 적인 DNA 부호 또는 히스톤 수정 catalyzes.
최근, 곁에 DNMT3A 효소 합성 CRISPR/dCas9 시스템의 사용 transcriptional 비활성화 용도가 변경 했습니다. DNMT3A catalyzes DNA 메 틸 화 내 생 유전자 발기인 및 다른 규제 영역 (그림 1B)18,20에 섬으로의 형성을 통해 transcriptional 억제 한다. 맥도날드 외.18 Vojta 외20 했다 보고 epigenome 유전자 침묵 또는 억압, 플라스 미드 배달 dCas9-DNMT3A 퓨전 시스템 향상 potently 수 보여주는 DNA 메 틸 화를 사용할 수 있는 첫 번째 저자 TSS18,20주위 시 토 신 메 틸 화. 맥도날드와 동료 증명 고용 전략의 중요 한 감소 (약 40%)에서 발생할 수 있습니다. 종양 억제기 유전자에서 CDKN2A mRNA 레벨18. 마찬가지로, 바흐 또는 IL6ST 유전자의 unmethylated 발기인 지역 타겟팅 증가 CpG 메 틸을 유전자 식20두 감소와 상관 관계를 보여줍니다. 우리 연구소는 최근 약하게 SNCA overexpression (그림 2)23의 병 적인 결과 대 한 DNA 메 틸 화를 사용 하 여 다른 용도로. SNCA intron 1 지역 내에서 DNA 메 틸 화에 선택적 향상 전략 기반으로 그것은 이전 PD와 치 매 Lewy 몸 (DLB) 두뇌24,25, hypomethylated 이기 위하여 보고 되었다 26. 이 hypomethylation SNCA overexpression, 따라서 제공 하는 치료 적 개입24,,2728에 대 한 매력적인 대상에 연결 되었습니다. 우리가 최근에 보여주었다 DNA 메 틸 화의 저수준 SNCA intron 1에서에서 hiPSC 파생 dopaminergic NPCs에 지역 SNCA triplication23PD 환자에서 얻은. 이 실험적인 모델의 장점은 NPCs 튼튼하게 문화에서 전파 하 또는 더 성숙한 뉴런으로 분화 세포 고기, 산화 등을 중재 하는 유전 요인 식별 하는 효율적인 심사를 사용 수 있다 스트레스와 apoptosis29. 또한,이 모델 시스템 환자에서 증상 발병 전에 발생 하는 개발 이벤트를 정리 하는 과학자를 수 있습니다. 또한, hiPSC에서 파생 된 NPCs 유전자 발현과 관련 된 세포 및 분자 경로 테스트 하는 훌륭한 도구를 나타냅니다. 중요 한 것은, 최신의 CRISPR/Cas9-epigenome 기술과 결합 하는 hiPSC 파생 NPCs 많은 신경 퇴행 성 질환에 대 한 “다음-세대 약물” 개발 용이 하 게 크게 수 있습니다.
SNCA 식의 병 적인 수준을 줄이기 위해, 우리는 최근 dCas9 DNMT3A 융해 단백질과 특별히 대상 CpG 메 틸 화 SNCA intron 1 (그림 2A) 내에 gRNA lentivirus 기반 시스템을 개발23. 이 프로토콜은 lentiviral 벡터 (LV) 설계 및 생산 세부 사항에 설명 합니다. LVs 나타내는 여러 가지 이유로 CRISPR/dCas9 구성 요소를 제공 하는 효과적인 수단, 즉 (i) 자신의 능력을 부피가 큰 DNA를 수행 삽입, (ii)30 셀을 나누어 및 nondividing를 포함 하 여 셀의 광범위 한 범위를 시험의 고효율 , 그리고 (iii) 최소한의 세포 독성 및 면역성 응답을 유도 하는 능력. 최근, 우리 SNCA 로커 스의 triplication 가진 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 LV 시스템을 적용 하 고 epigenome 편집의 배달에 대 한 정 맥 주사의 치료 잠재력을 시연 메 틸 화23 ( 도구 그림 2B). 실제로, LV-gRNA/dCas9-DNMT3A 시스템 SNCA intron 1 지역에서 DNA 메 틸 화에 상당한 증가 발생합니다. 이 증가 SNCA mRNA와 단백질23의 수준에 있는 감소와 일치합니다. 또한, SNCA downregulation PD 관련 고기 SNCA triplication/hiPSC-파생 dopaminergic 신경 (예, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존)23에 구출. 중요 한 것은, 우리 SNCA 식 LV-gRNA-dCas9-DMNT3A 시스템에서에서 감소는 고기는 누가 실시는 PD 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 대 한 특성이 있다 반전의 능력을 증명 SNCA triplication, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존23등. 이 프로토콜의 목표 이며 1) 생산의 프로토콜와 높은 tittered 바이러스 준비를 생성 하기 위한 최적화 된 LV 플랫폼의 농도 2) 성숙한 dopaminergic 될 꽃무늬 NPCs에 hiPSCs의 차별화를 설명 하기 위해 신경31,32 그리고 SNCA intron 1에서 대상 영역의 메 틸 화 수준의 특성화.
Lentiviral 플랫폼 주요 이점을 가장 인기 있는 벡터 플랫폼, 즉 adeno 관련 벡터 (AAVs), 큰 유전자 삽입33,34에 맞게 전 능력은 있다. AAVs 상당히 높은 수익률에 생성 될 수 있습니다 하지만 낮은 포장 용량을 보유 (< 4.8 kb), 모든-에-하나의 CRISPR/Cas9 시스템을 제공 하기 위한 그들의 사용을 타협. 따라서, 그것은 정 맥 주사의 플랫폼 제공된 CRISPR/dCas9 도구를 응용 프로그램에서 선택 될 것 이라고 보인다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 효과적으로 세포와 장기에 epigenome 편집 구성 요소를 제공 하는 연구를 위한 유용한 도구가 됩니다. 프로토콜 추가 벡터 식 카세트30,35내 요소의 cis에 수정 통해 벡터의 생산 및 표현 기능을 증가 하기 위하여 전략을 설명 합니다. 전략을 기반으로 소설에 시스템 개발 및 연구소에서 공부 하 고 1010 바이러스 성 단위 (VU) /mL30,35의 범위에서 바이러스 성 입자를 생산 하는 능력을 강조.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs 유전 질병의 맥락에서 특히 epigenome 편집을 위한 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다, (i) 수용 하기 위해 그들의 능력 때문에 주로 큰 DNA 페이로드 및 (ii) 효율적으로 transduce 다양 한 분할 및 nondividing 셀. 정 맥 주사의 큰 포장 효능은 특히 대형은 CRISPR/dCas9 시스템의 포장을 포함 하는 응용 프로그램에 대 한 유용 합니다. 이 관점에서 정 맥 주사 모두 한 CRISPR/Cas9 시스템의 배달에 대 한 선?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 칸 Neurotechnology 개발 상 (O.C.)을 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 일부 자금 O.C. (R01 NS085011).
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
References
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