Riktade DNA epigenomet redigering representerar en kraftfull terapeutisk metod. Det här protokollet beskriver produktion, rening och koncentration av allt-i-ett lentiviral vektorer härbärgerat den CRISPR-dCas9-DNMT3A transgenens för epigenomet redigeringsprogram i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda nervceller.
Användning av hiPSC-derived celler representerar en värdefull metod att studera mänskliga neurodegenerativa sjukdomar. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för differentiering av hiPSCs härrör från en patient med en tredubbling av alfa-synuklein genen (SNCA) locus i Parkinsons sjukdom (PD)-relevanta dopaminerga neuronala populationer. Ackumulerande bevis har visat att höga halter av SNCA är orsakande för utveckling av PD. känna den otillfredsställda måste upprätta nya terapeutiska metoder för PD, särskilt de inriktning regleringen av SNCA uttryck, vi nyligen utvecklat ett CRISPR/dCas9-DNA-metylering-baserade system för att modulera epigenetiskt SNCA transkription genom att berika metylering nivåer på regionen SNCA intron 1 tillsyn. Att leverera systemet, bestående av en död (inaktiverade) version av Cas9 (dCas9) smält med den katalytiska domänen av DNA methyltransferase enzym 3A (DNMT3A), en lentiviral vektor används. Detta system tillämpas på celler med en tredubbling av det SNCA locus och minskar SNCA-mRNA och proteinnivåer med ca 30% genom den riktade DNA-metyleringen av SNCA intron 1. De finjusteras nedreglering SNCA nivåer räddar sjukdomsrelaterade cellulära fenotyper. I det nuvarande protokollet, vi strävar efter att beskriva en steg för steg för att skilja hiPSCs i neurala stamceller (NPC) och etablering och validering av pyrosekvensering analyser för utvärdering av metylering profil i den SNCA intron 1. För att beskriva mer detaljerat det lentivirus-CRISPR/dCas9-system som används i dessa experiment, beskriver det här protokollet hur att producera, rena och koncentrera lentiviral vektorer och att uppmärksamma deras lämplighet för epigenomet och genomet-redigeringsprogram använder hiPSCs och NPCs. Protokollet är lätt anpassningsbar och kan användas för att producera hög titer lentiviruses för in vitro- och in vivo-program.
Flera epigenomet-redigering plattformar har nyligen framtagits för att rikta någon DNA-sekvenser i regioner som kontrollerar gene expression1,2. De skapa epigenomet-redigering verktyg är utformade för att (i) reglerar transkription, (ii) ändra posttranslationell Histon ändringar, (iii) ändra DNA-metylering och (iv) modulerar reglerande element interaktioner. Metoden med att förankra de transkription/kromatin modifierarna till en inaktiverad (döda) Cas9 (dCas9) upp från tidigare utvecklade epigenomet-redigering plattformar, såsom zink finger proteiner (ZFPs) och transkription aktivator-liknande effektorer (TALEs), härbärgerat en potent transkriptionell effektor domän smält (ED) till designade DNA-bindande domänen (DBD)3. Resultaten av den önska fenotypen som aktivering eller förtryck definieras av effektor molekylen förankras i de endogena loci (figur 1). För att skapa programmerbara transkriptionell aktivatorer, är dCas9/gärna moduler kopplade till VP164,5,6 (figur 1A), en viral aktiveringen domän som rekryterar Pol II och allmänna transkription maskiner. Ändring av detta system har omfattat VP64, en tetramer VP16 domäner, som tillhandahåller ett ännu mer robust aktiveringen ränta5,6. Systemet har lyckat använts att aktivera kodning och kodande regioner genom att rikta initiativtagare och reglerande element. Ännu viktigare, även om VP64 molekyler inte direkt ändra kromatinstruktur i målregionen, det rekryterar kromatin modifierare som binder resultat i nedfall av aktiv (euchromatin) markerar, bland annat som H3/H4 Acetylering och H3-K4 di / Tri-metylering5,6. Förutom VP64, har den p65 subuniten av mänskliga NF-κB anläggningen varit bundna till dCas9/gärna modul7. Intressant, den tjudra av dessa effektorer till regionerna uppströms av transkription start platser (TSSs) och inom initiativtagare resulterar i en stark gen induktion. VP64 och p65 effektorer kan dock också utöva de activatory effekterna samtidigt kopplad till de regioner som ligger nedströms TSSs och distala enhancers7,8. För att framkalla en mer robust transkriptionell reaktion, behöver flera dCas9-VP64 eller dCas9-p65 fusioner rekryteras till en enda mål locus9,10. Som sådan, har den senaste utvecklingen av nästa generations aktivatorer, som rekrytera flera effektor domäner av en enda dCas9-gärna komplexa, såsom SunTag, resulterat i en starkare aktiveringen anlagen jämföra med dCas9-VP64 fusion motsvarigheter11 , 12. en förbättrad transkriptionell aktivering har erhållits genom fusion av VP64, p65 och Rta (VPR), en transkription domän från gamma-herpesviruses, C-terminus dCas913 (figur 1A). Liknande CRISPR/dCas9 system har utvecklats för target-specifika förtryck (figur 1B).
Endogena gen förtryck kan uppnås med bakåtkompilerade repressor fusioner genom olika mekanismer (figur 1B). Det har visats att CRISPR/dCas9 system, kopplat till repressor DBD (även utan en effektor domän/s), effektivt kan tysta genernas uttryck medan bundna till en promotor eller uppströms/nedströms-TSS regioner3,6 ,14. Effekterna på transkription orsakas av Sterisk inblandning av transkription faktorn bindande och RNA-polymeras bearbetning. Dock är mer omfattande strategier nödvändiga, som genen förtryck av Sterisk hinder ensam räcker ofta inte för robust ljuddämpning. Den senaste utvecklingen av nästa generation av ljuddämpare baserat på CRISPR/dCas9 system transporterar transkriptionell repressor domäner (TRDs), Histon modifierare (H3-K9 di-/ tri-metylering, H3-K27 di-/ tri-metylering; H3-K36 di-/ tri-metylering, H3/H4 deacetylering), och DNA (CpG) metylering ledde till byggandet av epigenetiska bearbetar att låta mer robust tysta effekter4,5,15,16, 17,18,19,20. Det har visats att rekryteringen av dessa epigenetiska modifierare till DNA kan leda till bildandet av mer slutna och kondenserad kromatin, som vanligtvis genererar en mer potent ljuddämpningssystemet resultatet21,22. Oftast tysta domänen används med DBDs är i Krüppel-associerade ruta (KRAB)4,5. Rekrytering av faktorn har visat sig motsvara kromatin förändringar; mekanismerna för dessa ändringar är dock ännu vara klarlagd16,17,18. Det har nyligen visat att lokaliseringen av KRAB DNA kan främja montering av den Histon methyltransferase SETDB1 och Histon deacetylering (HDAC) NuRD komplexen, vilket tyder på möjligheten att dessa interaktioner medla bildandet av kromatin kondens och transkriptionell ljuddämpningssystemet3,13. Som ett alternativ, kan effektor domäner vara smält till DBDs att skapa en anpassad epigenetiska ljuddämpningssystemet protein. Detta system katalyserar direkt repressiva DNA märken eller Histon ändringar.
Användningen av syntetiska CRISPR/dCas9 system uppbundna till enzymet DNMT3A har nyligen varit repurposed för transkriptionell avaktivering. DNMT3A katalyserar DNA-metylering som utövar transkriptionell förtryck i hela bildandet av Heterokromatin på endogena gen promotorer och andra regulatoriska regioner (figur 1B)18,20. McDonald et al.18 och Vojta et al.20 var de första författarna att rapportera att DNA-metylering kan användas för epigenomet-nedtystning eller förtryck, visar att plasmid-levererade dCas9-DNMT3A fusion systemet kraftigt kan öka cytosin metylering runt TSS18,20. McDonald och medarbetare visat att anställningen av strategin kan resultera i en betydande minskning (ca 40%) i en tumörsuppressor gen nivåer CDKN2A mRNA18. Likaså visar inriktning regionen unmethylated arrangören av BACH eller IL6ST gener ökad metylering av CpG som har korrelerats med en tvåfaldig minskning i gen uttryck20. Vårt labb har nyligen repurposed användning av DNA-metylering för förmildrande patologiska resultaten av SNCA överuttryck (figur 2)23. Strategin bygger på selektiv förbättring i DNA-metylering inom regionen SNCA intron 1, som det har tidigare rapporterats vara hypometylering i PD och demens med Lewy organ (DLB) hjärnor24,25, 26. Detta hypometylering har kopplats till SNCA överuttryck, vilket ger ett attraktivt mål för terapeutisk intervention24,27,28. Vi visade nyligen en låg nivå av DNA-metylering i den SNCA intron 1 regionen i hiPSC-derived dopaminerga NPC erhålls från en PD patient med SNCA tredubbling23. Fördelen med denna experimentella modell är att NPC kan vara kraftfullt förökade i kultur eller ytterligare differentieras efter mogna nervceller, möjliggör en effektiv screening att identifiera genetiska faktorer som förmedlar cellulära fenotyper, inklusive oxidativ stress och apoptos29. Dessutom möjliggör detta modellsystem forskare att sammanfatta de utvecklingsmässiga händelser som inträffade före symtomdebut hos patienter. Dessutom utgör hiPSC-derived NPC ett bra verktyg för att testa de cellulära och molekylära vägar som är associerad med genuttryck. Ännu viktigare, kan hiPSC-derived NPC kombinerat med state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenomet teknik underlätta utveckling av ”nästa generations läkemedel” för många neurodegenerativa sjukdomar.
För att minska patologiska nivåer av SNCA uttryck, vi nyligen utvecklat ett lentivirus-baserat system som bär en dCas9-DNMT3A fusionsprotein och gärna till specifikt mål CpG metylering inom den SNCA intron 1 (figur 2A)23. Detta protokoll kommer att beskriva lentiviral vektor (LV) design och produktion i detalj. LVs utgör ett effektivt medel för att leverera CRISPR/dCas9 komponenter av flera skäl, nämligen (i) deras kapacitet att bära skrymmande DNA infogar, (ii) en hög effektivitet av transducing mängder av celler, inklusive både dela och nondividing celler30 , och (iii) deras förmåga att inducera minimal cytotoxiska och immunogent Svaren. Nyligen vi tillämpas LV systemet på hiPSC-derived dopaminerga neuron från en patient med en tredubbling av det SNCA locus och visat den terapeutiska potentialen hos LVs för leverans av epigenomet-redigering metylering verktyg23 ( Figur 2B). Faktiskt, ett LV-gärna/dCas9-DNMT3A system orsakar en betydande ökning i DNA-metylering i regionen SNCA intron 1. Denna ökning motsvarar minskningen av nivåerna av SNCA mRNA och protein23. Dessutom räddar SNCA nedreglering PD-relaterade fenotyper i SNCA tredubbling/hiPSC-derived dopaminerga neuroner (t.ex. mitokondriell ROS produktion och cell bärkraft)23. Ännu viktigare, visat vi att minskningen av SNCA uttryck av LV-gärna-dCas9-DMNT3A systemet är kapabelt att ångra de fenotyper som är karakteristiska för hiPSC-derived dopaminerga nervceller från en PD-patienten som bar SNCA tredubbling, såsom mitokondriell ROS produktion och cell livskraft23. Målet med detta protokoll är 1) att beskriva protokollet av produktion och koncentration av en optimerad LV-plattform för att generera hög-tittered viral preparat och 2) att beskriva differentiering av hiPSCs i NPC mönstrad för att bli mogen dopaminerga nervceller31,32 och karakterisering av metylering nivåerna av riktade regionen inom SNCA intron 1.
Lentiviral plattformar har en stor fördel över mest populära vektor plattformen, nämligen adeno-associerade vektorer (AAVs), som är den förres förmåga att rymma större genetiska skär33,34. AAVs kan genereras på betydligt högre avkastning men besitter en låg förpackningar kapacitet (< 4,8 kb), att äventyra deras användning för att leverera allt-i-ett CRISPR/Cas9-system. Det verkar således att LVs skulle vara den plattform-av-val i tillämpningarna som är inblandad i leveransen av CRISPR/dCas9 verktyg. Protokollet beskrivs här kommer därför ett värdefullt verktyg för forskare som önskar att effektivt leverera epigenomet-redigering komponenter till de celler och organ. Protokollet ytterligare beskriver strategin för att öka produktionen och uttryck funktionerna i vektorerna via en ändring i cis av elementen inom vektor uttryck kassett30,35. Strategin bygger på romanen system utvecklat och studerat i vårt labb och belyser dess förmåga att producera viral partiklar i intervallet 1010 viral enheter (VU) /mL30,35.
LVs har börjat dyka upp som fordonet val för epigenomet redigering, särskilt inom ramen för genetiska sjukdomar, främst på grund av deras förmåga att (i) rymma stor DNA nyttolaster och (ii) effektivt transduce ett brett utbud av delar och nondividing celler. Storförpackning effekten av LVs är särskilt fördelaktigt för de program som berör paketering av CRISPR/dCas9 system som är överdimensionerade. Ur detta perspektiv representerar LVs den plattform-av-val för leverans av allt-i-ett CRISPR/Cas9-system. A…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var delvis finansierad av utmärkelsen Kahn Neurotechnology utveckling (att O.C.) och nationella institut för hälsa och nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (NIH/NINDS) (R01 NS085011 att O.C.).
Equipment | |||
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture reagents | |||
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
p24 ELISA reagents | |||
Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids | |||
pMD2.G | Addgene | 12253 | |
pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
psPAX2 | Addgene | 12259 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction enzymes | |||
BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
PacI | New England Biolabs | R0547S | |
SphI | New England Biolabs | R0182S |