Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti
Summary
Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.
Abstract
L’uso di cellule derivate da hiPSC rappresenta un valido approccio per lo studio di malattie neurodegenerative umane. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSCs derivata da un paziente con la triplicazione del luogo del gene (SNCA) dell’alfa-synuclein nel morbo di Parkinson (PD)-popolazioni neuronali dopaminergici pertinenti. Raccogliendo la prova ha dimostrato che alti livelli di SNCA sono causativi per lo sviluppo del PD. riconoscere l’insoddisfatte necessario stabilire nuovi approcci terapeutici per PD, specialmente quelli targeting per la regolazione dell’espressione di SNCA , abbiamo recentemente ha sviluppato un sistema CRISPR/dCas9-DNA-metilazione-based per epigeneticamente modulano la trascrizione di SNCA arricchendo i livelli di metilazione presso la regione regolatrice di SNCA introne 1. A consegnare il sistema, costituito da un morto (disattivato) versione di Cas9 (dCas9) fuso con il dominio catalitico del 3A enzima DNA metiltransferasi (DNMT3A), viene utilizzato un vettore lentivirale. Questo sistema viene applicato alle celle con la triplicazione del locus SNCA e riduce la SNCA-mRNA e livelli della proteina di circa il 30% attraverso la metilazione del DNA mirato di SNCA introne 1. Il fine-tuned downregulation dei livelli SNCA Salva fenotipi cellulari correlati alla malattia. Il protocollo attuale, ci proponiamo di descrivere una procedura dettagliata per la differenziazione hiPSCs nella cellule progenitrici neurali (NPC) l’istituzione e la convalida di pyrosequencing saggi per la valutazione del profilo di metilazione in SNCA introne 1. Per strutturare in modo più dettagliato il sistema di lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizzato in questi esperimenti, questo protocollo descrive come produrre, purificare e concentrare vettori lentivirali e per evidenziare la loro idoneità per applicazioni epigenome – e -editing genomico utilizzando hiPSCs e NPC. Il protocollo è facilmente adattabile e può essere usato per produrre lentivirus di alto titolo per applicazioni in vitro e in vivo.
Introduction
Più piattaforme di editing-epigenome sono stati recentemente sviluppati per indirizzare eventuali sequenze di DNA nelle regioni che controllano l’espressione genica1,2. Gli strumenti di editing epigenome creati sono progettati per (i) regolare la trascrizione, (ii) modificare le modifiche post-traduzionali degli istoni, (iii) modificare la metilazione del DNA e (iv) modulano interazioni elemento regolatore. L’approccio di ancorare i modificatori di trascrizione/cromatina a un Cas9 (morto) disattivato (dCas9) generato da precedentemente sviluppati piattaforme epigenome di editing, come lo zinco dito proteine (ZFPs) e gli effettori di simil-attivatore di trascrizione (racconti), che harboring un dominio effector trascrizionale potente (ED) fuso a progettato dominio legante il DNA (DBD)3. I risultati del fenotipo desiderato come l’attivazione o la repressione è definito dalla molecola effettore ancorata ai loci endogene (Figura 1). Per creare attivatori trascrizionali programmabili, dCas9/gRNA moduli sono collegati a VP164,5,6 (Figura 1A), un dominio di attivazione virale che reclute Pol II ed il macchinario della trascrizione generale. La modifica di questo sistema ha incluso VP64, un tetramero di VP16 domini, fornendo un ancora più robusto attivazione tasso5,6. Il sistema è stato impiegato con successo per attivare le regioni codificanti e non codificanti mirando ai promotori ed elementi regolatori. Cosa importante, anche se VP64 molecole non modificano direttamente la struttura della cromatina della regione di destinazione, recluta i modificatori di cromatina che legano i risultati nella deposizione dei marchi attivo (l’eucromatina), tra cui come H3/H4 acetilazione e H3-K4 di / Tri-metilazione5,6. Oltre a VP64, la subunità p65 del complesso NF-κB umano ha stata legata alla dCas9/gRNA modulo7. È interessante notare che, il tethering di questi effettori per le regioni a Monte dei siti di inizio di trascrizione (TSSs) e all’interno di promotori si traduce in un’induzione genica forte. Tuttavia, VP64 e p65 effettori possono anche esercitare gli effetti attivatori pur essendo legata alle regioni situate a valle di TSSs e a distale rinforzatori7,8. Per suscitare una risposta trascrizionale più robusta, più fusioni dCas9-VP64 o dCas9-p65 devono essere assunti per un bersaglio singolo locus9,10. Come tale, il recente sviluppo di attivatori di prossima generazione, che reclutano domini effettrici multipli da un singolo dCas9-gRNA complesso, ad esempio SunTag, ha provocato una più forte capacità di attivazione confronto tra al dCas9-VP64 fusione controparti11 , 12. un’attivazione trascrizionale migliore è stato ottenuto mediante la fusione di VP64, p65 e Rta (VPR), un dominio di transattivazione da gamma-herpesvirus, fino al C-terminale di dCas913 (Figura 1A). Simili sistemi di CRISPR/dCas9 sono stati sviluppati per la repressione di target-specifici (Figura 1B).
Repressione del gene endogeno può essere raggiunto con fusioni derivati dal repressore attraverso una varietà di meccanismi (Figura 1B). È stato dimostrato che CRISPR/dCas9 sistemi, collegati al repressore DBD (anche senza un dominio effector/s), in modo efficiente possono tacere l’espressione genica mentre legato ad un promotore o a Monte/a valle-TSS regioni3,6 ,14. Gli effetti sulla trascrizione è causato dall’interferenza sterica del legame del fattore di trascrizione ed elaborazione di RNA polimerasi. Tuttavia, sono necessari approcci più completi, come repressione genica di sterico da solo spesso non è sufficiente per il silenziamento robusto. Il recente sviluppo della prossima generazione di silenziatori basati su sistemi CRISPR/dCas9 che trasportano domini di repressore trascrizionale (TRDs), i modificatori dell’istone (H3-K9 di-/ tri-metilazione, H3-K27 di-/ tri-metilazione; H3-K36 di-/ tri-metilazione, H3/H4 deacetilazione) e portato alla costruzione di strumenti epigenetici che permette più robusto silenziamento effetti4,5,15,16, la metilazione del DNA (CpG) 17,18,19,20. È stato dimostrato che l’assunzione di questi modificatori epigenetici al DNA può condurre alla formazione di più cromatina condensata e chiusa, che genera tipicamente un più potente silenziamento risultato21,22. Il dominio più comunemente silenziamento utilizzato con DBDs è la casella associata Krüppel (KRAB)4,5. L’assunzione del fattore è stata dimostrata per la corrispondenza con le modifiche della cromatina; Tuttavia, i meccanismi di queste modifiche sono ancora di essere chiarito16,17,18. Recentemente, è stato dimostrato che la localizzazione di KRAB al DNA possa promuovere l’Assemblea dell’istone metiltransferasi SETDB1 e i complessi di NuRD istone deacetilazione (HDAC), suggerendo la possibilità che queste interazioni mediano la formazione di condensazione della cromatina e trascrizione silenziante3,13. Come approccio alternativo, domini dell’effettore possono essere fusa a DBDs per creare una proteina di silenziamento epigenetica personalizzata. Questo sistema catalizza direttamente repressiva DNA marchi o modificazioni istoniche.
Recentemente, l’uso di sistemi CRISPR/dCas9 sintetici legato all’enzima di DNMT3A è stato reimpiegato per inattivazione trascrizionale. DNMT3a catalizza la metilazione del DNA che esercita la repressione trascrizionale durante la formazione dell’eterocromatina su promotori di geni endogeni e altre regioni regolarici (Figura 1B)18,20. McDonald et al.18 e Vojta et al.20 sono stati i primi autori a riferire che la metilazione del DNA può essere utilizzata per epigenome-genico o repressione, dimostrando che il sistema di fusione di plasmide-consegnato dCas9-DNMT3A potentemente può migliorare metilazione della citosina intorno il TSS18,20. McDonald e colleghe hanno dimostrato che l’occupazione della strategia può provocare una riduzione significativa (circa il 40%) in un gene oncosoppressore, CDKN2A mRNA livelli18. Allo stesso modo, targeting della regione non metilato promotore dei geni BACH o IL6ST Mostra aumentata metilazione di CpG che è stata correlata con una riduzione di duplice nell’ espressione genica20. Il nostro laboratorio ha recentemente riproposto l’uso di metilazione del DNA per l’attenuazione dei risultati patologici di SNCA sovraespressione (Figura 2)23. La strategia si basa sul potenziamento selettivo nella metilazione del DNA all’interno della regione di introne 1 SNCA , come precedentemente è stato segnalato per essere ipometilato nel PD e demenza con Lewy (DLB) corpi cervelli24,25, 26. Questo hypomethylation è stato collegato alla sovraespressione di SNCA , offrendo così un obiettivo attraente per intervento terapeutico24,27,28. Recentemente abbiamo mostrato un basso livello di metilazione del DNA nel SNCA introne 1 regione in dopaminergici hiPSC-derivati NPC ottenute da un paziente del Palladio con la triplicazione di SNCA 23. Il vantaggio di questo modello sperimentale è che gli NPC possono essere robustamente propagati nella cultura o ulteriormente differenziati nei neuroni maturi, che consente uno screening efficace identificare i fattori genetici che mediano fenotipi cellulari, tra cui ossidativo lo stress e l’apoptosi29. Inoltre, questo sistema modello permette agli scienziati di ricapitolare gli eventi inerenti allo sviluppo che si sono verificati prima dell’insorgenza dei sintomi nei pazienti. Inoltre, hiPSC-derivati NPC rappresentano un ottimo strumento per testare le vie cellulari e molecolari connesse con l’espressione genica. D’importanza, hiPSC-derivati NPC abbinato alla tecnologia state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome può facilitare notevolmente lo sviluppo di “farmaci di nuova generazione” per molte malattie neurodegenerative.
Per ridurre i livelli patologici di SNCA espressione, abbiamo recentemente sviluppato un sistema basato su lentivirus che trasportano una proteina di fusione dCas9-DNMT3A e gRNA specificamente metilazione di CpG di destinazione all’interno del SNCA introne 1 (Figura 2A)23. Questo protocollo descriverà vettore lentivirale (LV) progettazione e produzione in dettaglio. LVs rappresentano un mezzo efficace di fornire componenti di CRISPR/dCas9 per diversi motivi, vale a dire (i) la loro capacità di trasportare ingombrante DNA inserti, (ii) un’alta efficienza di trasduzione un’ampia gamma di cellule, compreso le cellule di divisione sia nondividing30 e (iii) loro capacità di indurre risposte citotossiche e immunogeniche minimale. Recentemente, abbiamo applicato il sistema di LV a neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente con la triplicazione del locus SNCA e dimostrato il potenziale terapeutico di LVs per la consegna di editing epigenome metilazione23 ( degli strumenti Figura 2B). Infatti, un sistema di LV-gRNA/dCas9-DNMT3A provoca un significativo aumento nella metilazione del DNA alla regione dell’introne 1 SNCA . Questo aumento corrisponde con la riduzione dei livelli di mRNA e proteina SNCA 23. Inoltre, SNCA downregulation Salva fenotipi PD-relative nel SNCA triplicazione/hiPSC-derivato dopaminergico neuroni (ad esempio, mitocondriale ROS produzione e cella vitalità)23. Cosa importante, abbiamo dimostrato che la riduzione dell’espressione di SNCA dal sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A è in grado di invertire i fenotipi che sono caratteristici per i neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente di PD che ha trasportato il SNCA triplicazione, quali mitocondriale ROS produzione e cellula attuabilità23. L’obiettivo del presente protocollo è 1) per delineare il protocollo di produzione e la concentrazione di una piattaforma ottimizzata di LV per la generazione di alta-risero preparati virali e 2) per descrivere la differenziazione di hiPSCs in NPC modellato per diventare maturo dopaminergici neuroni31,32 e la caratterizzazione dei livelli di metilazione della regione mirata all’interno di SNCA introne 1.
Lentivirali piattaforme hanno un vantaggio importante sopra la piattaforma più popolare di vettore, vale a dire adeno-associato vettori (AAVs), che è capacità l’ex di ospitare grandi inserti genetici33,34. Adenoassociati possono essere generate in rendimenti significativamente più elevati ma possiedono una capacità di confezionamento basso (< 4,8 kb), compromettendo il loro uso per la distribuzione di sistemi CRISPR/Cas9 all-in-one. Così, sembra che il LVs sarebbe la piattaforma di scelta nelle applicazioni coinvolte nella fornitura di strumenti CRISPR/dCas9. Pertanto, il protocollo descritto qui sarà uno strumento prezioso per i ricercatori desiderosi di fornire in modo efficace modifica epigenome componenti di cellule e organi. Il protocollo ulteriormente delinea la strategia per aumentare le capacità di produzione ed espressione dei vettori tramite una modifica in cis degli elementi all'interno del vettore espressione cassetta30,35. La strategia si basa sul romanzo sistema sviluppato e studiato nel nostro laboratorio ed evidenzia la sua capacità di produrre particelle virali nella gamma di 1010 unità virali (VU) / ml30,35.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs hanno cominciato ad emergere come il veicolo della scelta per l’editing di epigenoma, soprattutto nel contesto delle malattie genetiche, principalmente dovuto la loro capacità di (i) di ospitare grandi carichi utili di DNA e (ii) trasducono efficientemente una vasta gamma di divisione e cellule nondividing. L’efficacia di grande imballaggio del LVs è particolarmente utile per le applicazioni che coinvolgono imballaggio dei sistemi CRISPR/dCas9 che sono di grandi dimensioni. Da questa prospettiva, LVs rappresentano …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Kahn neurotecnologie Development Award (di O.C.) e istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) (R01 NS085011 di O.C.).
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
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