Visualisere værdiforringelse af endotel og Glial barrierer af neurovaskulære enhed under eksperimentelle Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo
Summary
Vi præsenterer her, protokoller for at undersøge værdiforringelse af neurovaskulære enhed under eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis in vivo. Vi behandle specifikt, hvordan du bestemme blod – hjerne barrieren permeabilitet og gelatinase aktivitet involveret i leukocyt migration på tværs af glia limitans.
Abstract
Den neurovaskulære enhed (NVU) er sammensat af mikrovaskulære endotelceller danner blod – hjerne barrieren (BBB), en endotel basalmembranen med integreret pericytes, og glia limitans sammensat af parenkymalt basalmembranen og astrocytic ende-feed omfavne abluminal aspekt af centralnervesystemet (CNS) microvessels. Ud over at opretholde CNS styrer homøostase i NVU immun celle indsmugling til CNS. Under immunosurveillance af CNS kan lave antal aktiverede lymfocytter krydser i endothelial barriere uden at forårsage BBB dysfunktion eller klinisk sygdom. Derimod under neuroinflammation som i multipel sklerose eller dens dyremodel kan eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) et stort antal af immunceller krydse BBB og efterfølgende glia limitans nåede til sidst CNS parenkym fører til klinisk sygdom. Immun celle migration i CNS parenkym er således en to-trins proces, der involverer en sekventiel migration over endotel og glial barrieren af NVU ansætte forskellige molekylære mekanismer. Hvis efter deres passage på tværs i endothelial barriere, T-celler støder deres beslægtet antigen på perivascular antigen-præsenterer celler deres lokale reaktivering vil indlede efterfølgende mekanismer fører til fokale aktivering af gelatinases, som vil sætte T-celler til at krydse den glial barriere og Indtast CNS parenkym. Herigennem, vurdering af både BBB permeabilitet og MMP aktivitet i rumlige korrelationen til immun celle ophobning i CNS under EAE tillader for at angive tab af integritet i endothelial og glial hindringer af NVU. Her viser vi hvordan du fremkalde EAE i C57BL/6 mus ved aktiv immunisering og efterfølgende analysere BBB permeabilitet in vivo, ved hjælp af en kombination af eksogene fluorescerende sporstoffer. Yderligere viser vi, hvordan man visualisere og lokalisere gelatinase aktivitet i EAE hjerner af in situ zymogaphy koblet til immunfluorescent stainings BBB kælderen membraner og CD45 + invaderende immunceller.
Introduction
Det centrale nervesystem (CNS) koordinerer alle krop og mentale funktioner i hvirveldyr, og CNS homeostase er afgørende for en korrekt kommunikation af neuroner. CNS homeostase er berettiget af den neurovaskulære enhed (NVU), som beskytter CNS fra blodet skiftende miljø. NVU er sammensat af CNS mikrovaskulære endotelceller, som er biokemisk unikke og etablere blod – hjerne barrieren (BBB) i kontinuerlig krydstale med pericytes, astrocytter, neuroner og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, oprettelse af to særskilte kælderen membraner1. I endothelial basalmembranen at ensheathes abluminal aspekt i endothelial celler, BBB havne et stort antal af pericytes og er sammensat af laminin α4 og laminin α5, ud over andre ECM proteiner2. Derimod parenkymalt basalmembranen består af laminin en1 og laminin en2 og omfavnet af astrocytic end-fødder. Parenkymalt basalmembranen sammen med astrocyte ende-fødder komponerer glia limitans, der udskiller CNS neuronal netværk fra cerebrospinalvæsken fyldt perivascular eller subarachnoidale rum3. På grund af den unikke arkitektur af NVU er immun celle indsmugling til CNS adskiller sig fra, at i perifere væv som det kræver en totrinsproces med immunceller, først misligholdelse i endothelial BBB og efterfølgende glia limitans for at nå CNS parenkym.
Multipel sklerose (MS) er en fælles neuroinflammatory sygdom i CNS, hvor et stort antal cirkulerende immunceller Angiv CNS og forårsage neuroinflammation, demyelinering og fokale tab af BBB integritet4. Tab af BBB integritet er en tidlige kendetegnende for MS, som angivet ved tilstedeværelsen af gadolinium kontrast styrke læsioner i CNS som visualiseret ved magnetisk resonans imaging (MR)5. Leukocyt ekstravasation i CNS opstår på niveau med postcapillary venules; de præcise mekanismer involveret i immun celle diapedesis på tværs af BBB basalmembranen og efterfølgende glial barriere er dog stadig at blive udforsket. Eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) fungerer som en dyremodel for MS og har bidraget betydeligt til vores nuværende viden om MS patogenese. For eksempel, er ved hjælp af EAE model det blevet opdaget at leukocyt ekstravasation opstår i en omstændelig proces, herunder en indledende tilfangetagelse og rullende trin medieret af selectins og mucin-lignende molekyler såsom P-selectin glycoprotein ligand (PSGL) -1, efterfulgt af integrin-afhængige fast anholdelse og kravler af T-celler på BBB endotelceller til eftergivende sider til diapedesis6.
Når T-celler har passeret i endothelial BBB og i endothelial basalmembranen, de har brug at støde deres beslægtet antigen på makrofager og dendritiske celler strategisk lokaliseret i leptomeningeal eller perivascular mellemrummene. Denne interaktion inducerer fokale produktion af pro-inflammatoriske mediatorer der udløser de efterfølgende mekanismer kræves for CNS væv invasion af immunceller via glia limitans7,8,9. Fokale aktivering af matrix-metalloproteinases (MMP) -2 og MMP-9 ændrer chemokine aktivering og inducerer nedbrydning af ekstracellulære matrix receptorer på astrocyte ende-fødder, hvilket er en forudsætning for immun celle migration på tværs af glia limitans ind i den CNS parenkym og til at fremkalde den kliniske symptomdebut EAE10,11.
Kombinere påvisning af CNS infiltrerer immun celle med BBB giver lækage og gelatinase aktivitet i CNS væv sektioner værdifulde oplysninger om funktionelle integritet i endothelial og glial barrieren i forbindelse med neuroinflammation. For eksempel, vi for nylig undersøgt de konstitutive tab i endothelial tight junction molekyle junctional vedhæftning molekyle (JAM)-B i immun celle indsmugling til CNS i forbindelse med EAE. I forhold til sund vildtype C57BL/6 mus, sund JAM-B-mangelfuld littermates viste ingen forringelse af BBB integritet, som det fremgår af in vivo permeabilitet vurdering ved hjælp af endogene samt eksogene røbestoffer12. I forbindelse med EAE, JAM-B-mangelfuld C57BL/6 mus viste afhjælpes sygdomssymptomer, som var forbundet med inflammatoriske celle diffusering i leptomeningeal og perivascular rum12. For at undersøge dette fænomen vi anvendte i situ zymography, så identifikation af gelatinase aktivitet for at teste, hvis manglende gelatinase aktivitet i JAM-B-mangelfuld mus kan være ansvarlig for den reducerede antallet af immunceller stand til at bryde den glia limitans12.
Givet tilgængeligheden af genmodificerede forskellige mus modeller mangler, fx forskellige BBB tight junction molekyler, der kan forårsage ændringer i BBB funktion, metoder til at undersøge BBB integritet er vigtigt. Derudover kan nyudviklede stoffer indvirke på NVU barrierer. Her viser vi hvordan du fremkalde EAE i C57BL/6 mus ved aktiv immunisering med myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i komplet Freund adjuvanser. Vi så forklare hvor hen til lokalisere immun celle infiltration over i endothelial og glial barrierer af NVU og hvordan at studere in vivo endotel og glial barriere integritet af in situ påvisning af eksogene roebestoffer og gelatinase aktivitet, henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her, en protokol for at fremkalde og overvåge EAE i C57BL/6 hunmus. Hunnerne er fortrinsvis valgt, og der er en forekomst af kvinder: mænd 3:1 i MS. For at vurdere sværhedsgraden af EAE, vi har gjort brug af en 3-punkts scoring ark. EAE sværhedsgraden er generelt scorede med hensyn til sværhedsgraden af motor dysfunktioner. Mus med avancerede stadier af EAE, dvs udstiller en score over 2 må ofres for at undgå unødvendige lidelser for dyrene. Derfor anbefales det at score mus med tætte mellemrum f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi parlamentsarbejdet Lydia Sorokin, der har delt sin oprindelige in situ zymography protokol10 med os.
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
References
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
- Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neurosciences. , (2017).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
- Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
- Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
- Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
- Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
- Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
- Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
- Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
- Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
- Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
- Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
- Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
- Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
- Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
- Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
- Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
- Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
- Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
