להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם – מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.
Abstract
יחידת נוירו-וסקולריים (NVU) מורכב microvascular תאי אנדותל ויוצרים את מחסום הדם – מוח (BBB), קרום המרתף אנדותל עם pericytes מוטבע, והלחין limitans עכשיו, דונלד על ידי קרום המרתף parenchymal, astrocytic סיום-feed חובק את ההיבט abluminal של מערכת העצבים המרכזית (CNS) microvessels. בנוסף לשמירה על מערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס NVU שולטת תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים. במהלך immunosurveillance של מערכת העצבים המספרים הנמוכים של לימפוציטים מופעל תוכלו לחצות את המכשול אנדותל מבלי לגרום BBB בתפקוד או מחלה קלינית. לעומת זאת, במהלך neuroinflammation כגון טרשת נפוצה או במודל חיה שלה ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) מספר גדול של תאים חיסוניים יכולים לחצות BBB ובעקבות כך את limitans עכשיו, דונלד בסופו של דבר להגיע CNS parenchyma מובילים למחלות קליניות. נדידת תאים חיסוניים אל CNS parenchyma ולכן הוא תהליך בן שני שלבים זה כרוך העברה רציפה לאורך המכשול אנדותל, גליה של NVU העסקת ברורים המנגנונים המולקולריים. אם בעקבות מעבר שלהם על פני המכשול אנדותל, תאי T פוגשים אנטיגן cognate שלהם על תאים אנטיגן perivascular שלהם הפעלה מחדש המקומי תיזום מנגנונים הבאים מובילים לקראת הפעלת מוקד של gelatinases, אשר יאפשר תאי T לחצות את מחסום גליה ולהזין CNS parenchyma. לפיכך, הערכת, BBB חדירות והן פעילות MMP קורלציה מרחבית על הצטברות תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים במהלך EAE מאפשרת לציין אובדן שלמות של חסמי אנדותל, גליה NVU. אנו כאן מראים כיצד לגרום EAE בעכברים C57BL/6 על ידי חיסון פעיל וכיצד לנתח לאחר מכן BBB חדירות ויוו באמצעות שילוב של המשדרים פלורסנט אקסוגני. עוד נראה, כיצד להמחיש, בתרגום gelatinase הפעילות במוח EAE מאת באתרו zymogaphy מצמידים stainings immunofluorescent של BBB המרתף ממברנות ו CD45 + תאי מערכת החיסון הפולשים.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית (CNS) קואורדינטות הגוף וכל התפקודים המנטליים גולגולת, הומאוסטזיס CNS חיוני עבור תקשורת נאותה של נוירונים. CNS הומאוסטזיס היא מוצדקת על ידי היחידה נוירו-וסקולריים (NVU), אשר מגן על מערכת העצבים סביבה המשתנים של זרם הדם. NVU מורכב CNS microvascular אנדותל תאים, אשר מבחינה ביוכימית ייחודיים ולהקים את מחסום הדם – מוח (BBB) ב crosstalk רציפה עם pericytes, האסטרוציטים, נוירונים ורכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), הקמת שני ממברנות המרתף ברורים1. קרום המרתף אנדותל ensheathes את ההיבט abluminal של תאי אנדותל BBB בנמלים מספר גבוה של pericytes והוא מורכב laminin α4 וα5 laminin, בנוסף חלבונים אחרים ECM2. לעומת זאת, קרום המרתף parenchymal מורכב laminin α1 ו laminin α2 ואת מוזמנת על ידי סיום astrocytic-מטר. קרום המרתף parenchymal יחד עם אסטרוציט הסוף-רגל מלחינה את limitans עכשיו, דונלד שמבודד הרשת העצבית CNS השדרתי מלא perivascular או חללים תת-עכבישי3. בשל הארכיטקטורה הייחודית של NVU, תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים היא נבדלת כי לתוך רקמות היקפיים כפי שהוא דורש תהליך בן שני שלבים עם תאים חיסוניים, קודם פורצים BBB אנדותל ובעקבות כך את limitans עכשיו, דונלד על מנת להגיע אל CNS parenchyma.
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה נפוצה neuroinflammatory של מערכת העצבים, שבו מספר רב של מחזורי תאים חיסוניים להזין את מערכת העצבים ולגרום neuroinflammation, demyelination, ואובדן מוקד של BBB שלמות4. ההפסד של BBB שלמות הוא סימן ההיכר המוקדמים של MS, כפי שצוין על ידי הנוכחות של ניגוד גדוליניום שיפור נגעים ב מערכת העצבים כמו על ידי תהודה מגנטית (MRI)5. ליקוציט extravasation לתוך מערכת העצבים מתרחשת ברמה של postcapillary venules; עם זאת, המנגנון המדויק מעורב diapedesis תא החיסון על-פני קרום המרתף BBB ובעקבות כך למכשול גליה נשארים כדי להבטיח את הזמנתכם. ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) משמש במודל חיה עבור MS, והוא תרם באופן משמעותי את הידע הנוכחי שלנו על פתוגנזה MS. למשל, באמצעות מודל EAE זה כבר גילו כי ליקוציט extravasation מתרחשת בתהליך רב שלבי, כולל של הלכידה הראשונית, מתגלגל שלב מתווכת על-ידי selectins ומולקולות mucin דמוי כגון בחירת שמלות P ליגנד גליקופרוטאין (PSGL)-1, שהופעלו על ידי מעצר המשרד תלויי-אינטגרין סריקה של תאי T על תאי אנדותל BBB הצדדים מתירניות עבור diapedesis6.
ברגע T תאים חצו BBB אנדותל, קרום המרתף אנדותל, הם צריכים להיתקל שלהם אנטיגן cognate מקרופאגים או תאים דנדריטים לשפות אחרות באופן אסטרטגי את החללים leptomeningeal או perivascular. אינטראקציה זו גורם הייצור מוקד של מתווכים פרו-דלקתיים על ההדק המנגנונים הבאים הנדרשים לפלישה CNS רקמה של תאים חיסוניים באמצעות8,97,limitans עכשיו, דונלד. הפעלת מוקד של מטריקס-metalloproteinases (MMP)-2 ו- MMP-9 הפיצולים כימוקין הפעלה ומשרה השפלה של מטריצה חוץ-תאית רצפטורים על אסטרוציט סוף-כפות רגליים, המהווה תנאי הכרחי לקבלת החיסון תא העברה על-פני limitans עכשיו, דונלד לתוך CNS parenchyma, כדי לעודד הופעת התסמינים הקליניים של EAE10,11.
שילוב של זיהוי של CNS שחדר תא החיסון עם BBB זליגת ופעילות gelatinase בסעיפים רקמות CNS מספק מידע חשוב אודות שלמות פונקציונלית של המכשול אנדותל, גליה בהקשר של neuroinflammation. למשל, לאחרונה חקרנו. אובדן המכונן של המולקולה אדהזיה מהחיבור מולקולה צומת חזק אנדותל (ריבה)-B תא החיסון סחר לתוך מערכת העצבים בהקשר של EAE. לעומת עכברים C57BL/6 פראי-סוג בריא, בריא הארנבונים מאותה חשוכת-B-ריבה הראה אין ליקוי של BBB שלמות כפי שמוצג על ידי הערכת חדירות ויוו באמצעות המשדרים אנדוגני, כמו גם אקסוגני12. בהקשר של EAE, ריבה חשוכת-B C57BL/6 עכברים הראה תסמיני המחלה יושבחו, אשר היה קשור עם תאים דלקתיים השמנה leptomeningeal ו- perivascular רווחים12. לחקור תופעה זו והגשנו בקשה בחיי עיר zymography, המאפשר זיהוי של פעילות gelatinase כדי לבחון אם חוסר פעילות gelatinase בעכברים חשוכת-ריבה-B עשוי להיות אחראי על המספרים מופחתת של תאים חיסוניים מסוגל לפרוץ עכשיו, דונלד limitans12.
נתון הזמינות של שונות מהונדסים גנטית עכבר מודלים חסר, למשל, מולקולות צמוד לצומת BBB שונות העלולות לגרום שינויים בתפקוד BBB, מתודולוגיות על חקירת BBB שלמות חשובים. בנוסף, פיתח תרופות יכול להשפיע על NVU מחסומים. הנה אנחנו מראים כיצד לגרום EAE בעכברים C57BL/6 על ידי חיסון פעיל המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א)-פפטיד aa35-55 adjuvants של שלמה פרוינד. אז נסביר איך למקם תא החיסון חדירה מעבר חסמי אנדותל, גליה NVU וכיצד לומדים המכשול אנדותל, גליה ויוו שלמות על ידי זיהוי באתרו של המשדרים אקסוגני ופעילות gelatinase, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול זירוז ולפקח EAE בעכברים C57BL/6 הנשי. נקבות מעדיפים נבחרו, ואין שיעור של נשים: הגברים של 3:1 ב- MS. כדי להעריך את חומרת EAE, עשינו שימוש גיליון הבקיע 3 נקודות. חומרת EAE הוא הבקיע בדרך כלל ביחס לחומרת בתפקוד מוטורי. עכברים עם מתקדמים בשלבים של EAE, קרי מפגין ציון מעל 2 צריך להקריב כד…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר בהכרת תודה לידיה סורוקין, מי שיתף אותה המקורי באתרו zymography פרוטוקול10 איתנו.
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
References
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
- Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
- Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
- Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neurosciences. , (2017).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
- Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
- Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
- Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
- Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
- Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
- Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
- Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, (2007).
- Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
- Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis–a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
- Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
- Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
- Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
- Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
- Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
- Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
- Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
- Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
- Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
- Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
