Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo

Résumé

Nous présentons ici les protocoles pour enquêter sur la dépréciation de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo. Nous abordons plus précisément comment déterminer la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique et activité de gélatinase impliquée dans la migration des leucocytes à travers la glia limitans.

Résumé

L’unité neurovasculaire (UNV) est composée de cellules endothéliales microvasculaires formant la barrière sang - encéphalique (BHE), une membrane basale endothéliale avec péricytes embarqués, et le glia limitans composé par la membrane basale parenchymateuse et astrocytes fin-feed embrassant l’aspect abluminal des microvaisseaux de système nerveux central (SNC). En plus de maintenir les CNS homéostasie l’UNV contrôle traite des cellules immunitaires dans le SNC. Au cours de l’immunosurveillance du SNC des lymphocytes activés en faibles effectifs peuvent traverser la barrière endothéliale sans causer le dysfonctionnement BBB ou cliniques de la maladie. En revanche, au cours de la neuro-inflammation comme dans la sclérose en plaques ou son modèle animal encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) un grand nombre de cellules immunitaires peut croiser le BBB et par la suite la glia limitans atteignant le parenchyme de la CNS conduisant à la maladie clinique. Migration de cellules immunitaires dans le parenchyme de la CNS est donc un processus en deux étapes qui implique une migration séquentielle à travers la barrière endothéliale et gliale de l’UNV employant les mécanismes moléculaires distincts. Si après leur passage à travers la barrière endothéliale, lymphocytes T rencontrent leur apparenté antigène sur les cellules présentatrices d’antigène périvasculaires, leur réactivation locale va initier les mécanismes conduisant à l’activation de focale des gélatinases, qui permettra aux lymphocytes T à traverser la barrière gliale et entrer dans le parenchyme de la CNS. Ainsi, évaluer tous les deux, perméabilité BBB et activité du MMP en corrélation spatiale à l’accumulation de cellules immunitaires dans le SNC au cours de l’EAE permet de spécifier la perte d’intégrité des barrières endothéliales et gliales de l’UNV. Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active et analyser par la suite la perméabilité BBB in vivo à l’aide d’une combinaison des traceurs fluorescents exogènes. Nous montrons également, comment visualiser et localiser l’activité gélatinase dans les cerveaux de l’EAE en zymogaphy in situ, couplé à des salissures par immunofluorescence des membranes basales BBB et CD45 + invasion des cellules immunitaires.

Introduction

Le système nerveux central (CNS) coordonne tous les corps et les fonctions mentales chez les vertébrés, et homéostasie CNS est essentiel pour une bonne communication des neurones. L’homéostasie du CNS est justifié par l’unité neurovasculaire (UNV), qui protège le système nerveux central du milieu changeant de la circulation sanguine. Le NVU est composé de cellules endothéliales microvasculaires CNS, qui sont biochimiquement unique et mettre en place la barrière sang - encéphalique (BHE) en continu diaphonie avec les péricytes et astrocytes, neurones, constituants de la matrice extracellulaire (ECM), instituant deux distinctes des membranes basales¹

Protocole

Toutes les études ont été menées au titre des directives conformément à la législation suisse sur la protection des animaux et ont été approuvés par l’Office vétérinaire Suisse du Canton de Berne, (numéro d’autorisation : BE 31/17 et être 77/18).

1. logement de souris C57BL/6 dans les conditions (SPF) gratuites agent pathogène spécifique

1. Cycle de souris communes dans des cages individuelles ventilés avec un 12/12 h lumière-obscurité. Fournir de la nourriture et l’eau ad libitum. Pour superviser la qualité microbiologique des souris, la cohorte expérimentale a subi une surveillance de la santé trimestrielle par literie sale sentine....

Résultats

Évaluation de l’évolution clinique de l’EAE chez les souris C57BL/6 devrait se traduire par une courbe de la maladie comme illustré à la Figure 2 a et variations dans le poids de corps de souris tels que présentés dans la Figure 2 b. C57BL/6 souris immunisées avec MOGaa35-55 habituellement commencent à développer des symptômes de la maladie autour de jour 10-12 après immunisation active (Figure 1 a). En général, souris immunisées mo.......

Discussion

Nous présentons ici un protocole pour induire et contrôler l’EAE chez les souris C57BL/6 femelles. Les femelles sont préférentiellement choisies, et on observe une incidence des femmes : hommes de 3:1 dans la SP. Pour évaluer la gravité de l’EAE, nous avons fait utiliser une feuille de notation de 3 points. Gravité de l’EAE est généralement marquée par rapport à la gravité des dysfonctionnements moteurs. Souris avec pointe de stades de l’EAE, c'est-à-dire présentant un score supérieur à 2 devrait être sacrifié pour évite.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps anti-lapin AMCA	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Magasin à 4 ° ; C; protéger de la lumière
Anticorps anti-CD45 (30F11)	Pharmingen	07-1401	Stocker à 4 ° ; C
Anticorps anti-laminine	DAKO	Z0097	Stocker à 4 ° ; C
Nourriture d’élevage	par exemple PROVIMI KLIBA SA	3336
Cages ventilées individuellement, ligne bleue de type II ou III,	par exemple Tecniplast	1145T, 1285L
BSA fraction V	Applichem	A1391	Stocker à 4 ° ; C
Gélatine froide	Sigma-Aldrich	G 9391
Pot Coplin + support,	par ex. Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1 ; H552.1
Cy3 anticorps anti-rat	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Stocker à 4 ° ; C; protection contre la lumière
Couvercles 24 x 40 mm # 1	par exemple Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10 000 MW)	par exemple Sondes moléculaires	D22910	Stocker à -20 ° ; C; protéger de la lumière
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Se conserve à -20 ° ; C; protéger de la lumière Kit de
dosage de gélatinase/collagénase EnzChek  ;	Thermo Fisher Scientific ; EnzCheck	E12055	Stocker à -20 ° ; C; protection de la forme légère
Souris femelles C57BL/6J (8-12 semaines)	par exemple Janvier Labs		Femelles, 8-12 semaines
Boîte de congélation pour lames d’histologie	, par exemple Carl Roth GmbH + Co. KG	2285.1
18G x 1½ ; ’ ’ aiguille d’injection (1,2 mm x 40 mm),	par exemple BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾ ; ’ ’ &ndash ; Aiguille d’injection n° 20 (0,4 mm x 19 mm),	par exemple BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½ ; ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) aiguille d’injection	, par exemple BD, BD Microlance 3	304000
Incomplete Freund' s adjuvant (IFA)	e.g. Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Stocker à 4° ; C
Entretien alimentaire	, p.ex. PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 peptide	pex. GenScript		Store à -80 ° ;
Lames de microscope C (Superfrost Plus) Thermo	Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	par exemple BD	231141	Store à 4 ° ; C  ;
NaCl 0,9 %	B. Composé	3535789
O.C.T. de Braun (Tissue-Tek )	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½ ; ’ '	B. Braun	9151125S
Paraformaldéhyde	Merck	30525-89-4
Toxine coquelucheuse	, p. ex. List biological laboratories, Inc.	180	Magasin à 4 ° ; C
poly(alcool vinylique) (Mowiol 4-88)	Sigma-Aldrich	81381
Inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche)	Sigma-Aldrich	4693132001	Stocker à 4 ° ; Stylo
répulsif, par exemple DAKO Pen	par exemple DAKO	S2002
film d’étanchéité, par exemple Parafilm M,	par exemple Sigma-Aldrich	P7793
gel de silice	, par exemple Carl Roth GmbH + Co., KG	9351.1
Ciseaux à coudre	F.S.T	15012-12
seringue 1 ml	, par exemple PRIMO	62.1002
seringue 10 ml	, par exemple CODAN Medical ApS	2022-05
système de vaporisation Univentor 400	UNO. Bv

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