Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo
Summary
Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood – brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.
Abstract
La unidad neurovascular (NVU) se compone de células endoteliales microvasculares formando la barrera blood – brain (BBB), una membrana basal endotelial con pericitos encajado, y la glia INCURVATA4 compuesta por la membrana basal parenquimal y astrocíticos alimentación final abarca el aspecto abluminal de microvasos del sistema nervioso central (SNC). Además de mantener el CNS homeostasis el NVU controla tráfico de células inmunes en el SNC. Durante el ataque del SNC bajo número de linfocitos activados puede cruzar la barrera endotelial sin causar disfunción BBB o enfermedad clínica. En contraste, durante la neuroinflamación tales como esclerosis múltiple o su modelo animal encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) un gran número de células inmunes puede cruzar el BBB y posteriormente la glia INCURVATA4 eventualmente alcanzar el parénquima de la CNS hacia la enfermedad clínica. Migración de células inmunes en la parenquimia del CNS es así un proceso de dos etapas que implica una migración secuencial a través de la barrera endotelial y glial de NVU empleando distintos mecanismos moleculares. Si después de su paso a través de la barrera endotelial, células T encuentran su antígeno cognado en células presentadoras de antígenos perivasculares su reactivación local iniciará posterior mecanismos que conducen a la activación focal de matrilisina, que permitirá a las células T cruzar la barrera glial y entrar en el parénquima del CNS. Por lo tanto, evalúe la permeabilidad BBB y actividad MMP en correlación espacial con acumulación de células inmunitarias en el SNC durante la EAE permite para especificar la pérdida de la integridad de las barreras endoteliales y gliales del NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa y posteriormente analizar permeabilidad BBB en vivo usando una combinación de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos además, cómo visualizar y localizar la actividad gelatinasa en el cerebro de EAE por zymogaphy in situ junto a los stainings inmunofluorescentes de las membranas del sótano BBB y CD45 + invade las células inmunes.
Introduction
Sistema nervioso central (SNC) coordina todos los cuerpo y las funciones mentales en los vertebrados, y homeostasis del CNS es esencial para una adecuada comunicación de las neuronas. Homeostasis de la CNS está garantizada por la unidad neurovascular (NVU), que protege el SNC desde el ambiente cambiante de la corriente sanguínea. El NVU se compone de células endoteliales microvasculares de la CNS, bioquímicamente único y establecen la barrera blood – brain (BBB) en continua interferencia con pericitos, astrocitos, neuronas y componentes de la matriz extracelular (ECM), establecimiento de dos las distintas membranas del sótano1. La membrana basal endotelial que ensheathes el aspecto abluminal de las células endoteliales de BBB alberga un alto número del pericitos y se compone de laminina α4 y α5 del laminin, además de otras proteínas de ECM2. En contraste, la membrana basal parenquimal consta de laminina α1 y α2 de laminina y es abrazada por fin pies astrocíticos. La membrana basal parenquimal junto con los astrositos final-pies compone el INCURVATA4 de glia que segrega la red neuronal del CNS de la llena de líquido cerebroespinal perivascular o espacios subaracoideos3. Debido a la arquitectura única del NVU, células inmunitarias trata hacia el SNC es distinto que en los tejidos periféricos ya que requiere un proceso de dos pasos con las células inmunes, primero incumplimiento BBB endotelial y posteriormente la glia INCURVATA4 a fin de alcanzar el parénquima de la CNS.
Esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad común de la capensis del CNS, en la que un gran número de células inmunes circulantes entre el SNC y causar neuroinflamación, desmielinización y pérdida focal de BBB integridad4. Pérdida de la integridad BBB es un sello temprano de MS, como se indica por la presencia de contraste de gadolinio mejora las lesiones en el SNC como visualizado por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)5. Extravasación del leucocito en el SNC se produce a nivel de vénulas postcapilares; sin embargo, los mecanismos precisos involucrados en la diapedesis celular inmune a través de la membrana del sótano BBB y posteriormente la barrera glial quedan por explorarse. Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como un modelo animal para MS y ha contribuido significativamente a nuestro conocimiento actual sobre la patogenia de la EM. Por ejemplo, utilizando el modelo EAE se ha descubierto que la extravasación del leucocito ocurre en un proceso de varios pasos, incluyendo una captura inicial y balanceo paso mediado por selectinas y moléculas de mucina-como como ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido por detención firme dependiente de integrinas y arrastre de células T en las células endoteliales de BBB a lados permisivas por diapedesis6.
Una vez que las células T han cruzado el BBB endotelial y la membrana basal endotelial, que necesitan encontrar su antígeno cognado en macrófagos o células dendríticas localizadas estratégicamente en los espacios de leptomeningeal o perivascular. Esta interacción induce producción focal de mediadores pro-inflamatorios disparo los mecanismos posteriores necesarios para la invasión del tejido del CNS de células inmunes por la glia INCURVATA47,8,9. Focal activación de metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 y MMP-9 altera la activación de chemokine e induce la degradación de receptores de matriz extracelular en astrositos final-pies, que es un prerrequisito para inmune migración de la célula a través de la INCURVATA4 de glia en la Parénquima de CNS e inducir la aparición de síntomas clínicos de EAE10,11.
Combina la detección de CNS infiltración celular inmune con BBB actividad salida y gelatinasa en las secciones de tejido de CNS ofrece información valiosa sobre la integridad funcional de la barrera endotelial y glial en el contexto de la neuroinflamación. Por ejemplo, hemos investigado recientemente la pérdida constitutiva de la molécula de adherencia junctional de molécula endotelial ensambladura apretada (JAM)-B en el tráfico de células inmunes en el SNC en el contexto de la EAE. No comparado con saludables ratones C57BL/6 de tipo salvaje, sanas hermanos de camada de mermelada-B-deficiente mostraron ningún deterioro de la integridad BBB como se muestra en la evaluación de la permeabilidad in vivo utilizando marcadores endógenos como exógenos12. En el marco de la EAE, ratones C57BL/6 B-mermelada-deficiente mostraron síntomas de la enfermedad mejoró, que se asoció con captura de células inflamatorias en los espacios de leptomeningeal y perivascular12. Para examinar este fenómeno aplicamos zymography en situ , que permita la identificación de la actividad gelatinasa para probar si la falta de actividad gelatinasa en ratones deficientes en B-atasco puede ser responsable por el reducido número de células inmunes capaces de romper la glia INCURVATA412.
Dada la disponibilidad de diferentes genéticamente ratón modelos carece de, por ejemplo, diferentes moléculas de ensambladura apretada BBB que pueden provocar cambios en la función BBB, metodologías para investigar la integridad BBB son importantes. Además, fármacos recientemente desarrollados podrían impactar sobre las barreras NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa con la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG)-péptido aa35-55 en adyuvantes de Freund completo. A continuación explicamos cómo localizar la infiltración de células inmunitarias a través de las barreras endoteliales y gliales del NVU y cómo estudiar la integridad de la barrera endotelial y glial en vivo por la detección in situ de marcadores exógenos y la actividad gelatinasa, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un protocolo para inducir y controlar EAE en ratones C57BL/6 femeninos. Preferentemente se eligen las hembras, y hay una incidencia de las mujeres: los hombres de 3:1 en MS. Para evaluar la severidad de la EAE, hicimos uso de una hoja de puntuación de 3 puntos. Severidad de la EAE se anotó generalmente con respecto a la gravedad de los trastornos motores. Ratones con avanzadas fases de la EAE, es decir, exhibiendo una puntuación por encima de 2 debería ser sacrificado para evitar sufrimiento innece…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sorokin de Lydia, que compartió con nosotros su original en situ zymography de protocolo10 .
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
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