木管化カブトムシの付属物の走査型および透過型電子顕微鏡の試料調製方法
Summary
昆虫センシラの超構造を観察するために、走査電子顕微鏡と透過電子顕微鏡(それぞれSEMおよびTEM)のサンプル調製プロトコルを研究で提示した。TEMでサンプル変形を避けるためにTween 20を固定に添加した。蛍光顕微鏡法はTEMにおけるスライス精度を向上させるのに役立った。
Abstract
このレポートでは、両方のタイプの電子顕微鏡に対して、木管粉カブトムシ、クロロフォラス・カラガナ・シー&ワン(2012)の付属物を調製して実証したサンプル調製法および透過型電子顕微鏡観察方法について説明した。走査型電子顕微鏡(SEM)サンプル調製プロトコルは、一連のエタノール浴におけるサンプル化学固定、脱水、乾燥、スパッタコーティングに基づいていました。Tween20(ポリオキシエチレンソルビタンラウレート)を固定液と洗浄液に添加することにより、木除けカブトムシの昆虫体表面をよりきれいに洗浄した。本研究では、透過電子顕微鏡(TEM)の試料調製には、固定、エタノール脱水、樹脂への埋め込み、蛍光顕微鏡を用いた位置決め、切除、染色を含む一連のステップが含まれる。Tween 20を用いた固定剤は、木田の虫体壁をTween 20なしでより簡単に貫通し、その後体内の組織や臓器をより良く固定し、昆虫感覚超構造の透明な透過電子顕微鏡観察を生み出した。この調製の次のステップは、蛍光顕微鏡法を用いて標的感覚位置の精度を高めることによって、樹脂ブロックに埋め込まれた試料中の昆虫感覚の位置を決定することでした。これにより、スライス精度が向上しました。
Introduction
走査型電子顕微鏡は、多くの形態研究において重要なツールであり、SEMは表面構造1、2を示している。透過型電子顕微鏡法の魅力は、細胞のアーキテクチャや小器官の超構造から、高分子複合体やタンパク質の構造まで、ナノメートルスケールで幅広い生体構造を研究できるということです。TEM は内部構造3、4、5を示しています。
Coleopteraは、約182の家族と350,000種を含む昆虫の最大のグループです。コレオプテランの昆虫、特に木を退屈するカブトムシのほとんどは植物を食べ、その多くは森林や果樹の重要な害虫であり、木に壊滅的な被害を与える6.現在、化学生態学説に基づく害虫の予防・防除集団は、7.1.1の注目を集めている。効率的で低毒性、無公害のフェロモン制御法が有効な方法8となっている。昆虫の形態と超構造を研究することは、昆虫化学生態学研究の重要な部分です。走査電子顕微鏡と透過電子顕微鏡(SEMとTEM)は、それらの形態と内部解剖学を研究するために大きな効果を発揮します。しかし、電子顕微鏡(EM)用の昆虫試料の調製中に、観察部位の客観性および真正性が9に影響を受ける可能性がある。一般に、昆虫のSEM試料調製には、洗浄、組織固定、脱水、メタセシス、乾燥、およびスパッタコーティング10が必要である。木をつなぐカブトムシが生きる複雑な環境のために、体表面はしばしば様々な汚染物質を有し、その付属物はしばしば多くの細長い長いセンシラまたは毛先を有する。特に、一部の木ボラーは、現場で直接収集し、その後、新鮮さを確保するために液体を固定するために入れて、その後、実験室で洗浄実験室で利用できない。サンプルが最初に固定され、次に洗浄された場合、グルタルアルデヒドがサンプルに強く固定するため、明らかに破片を除去することははるかに困難です。トゥイーン20は、水の表面張力を低下させ、洗濯物表面の水の濡れ性を向上させるなど、洗浄工程において重要な役割を果たす界面活性剤11、12、13、14である。本研究では、液体の表面張力を低減する固定液とPBS洗浄液にTween20を添加し、SEMで体表面をクリーナーさせた木張りカブトムシの体表面に汚れが付着するのを防止した。
TEMを使用して、昆虫の異なる器官上のセンシラをスライスして、その中の明確な構造を明らかにし、感覚機能を分析するための基礎を提供することができる。木除けカブトムシのような被検昆虫が大きく、体壁がかなりの程度の硬化を有する場合、固定剤は昆虫体内の臓器組織を十分に飽和させることができない。トゥイーン20は、汚れの分散および懸濁能力を高めることができる。本研究では、Tween 20を固定液に加えて、木張りカブトムシの昆虫体壁への固定液の浸透を促進し、表皮11、12、13の変形および崩壊を回避した。さらに、一般的なスライス技術を使用して、特にいくつかの小さなセンシラ15のために、センシラの異なるタイプを正確に見つけることが困難である。従来のTEMサンプル調製に基づいて、本研究は蛍光顕微鏡とSEMを組み合わせて埋め込みブロック内の昆虫感覚の位置を決定し、スライス精度を向上させた。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、木材用カブトムシの走査および透過電子顕微鏡のサンプル調製スキームを紹介した。代表的な研究対象として虫の付属物を用いて、従来のサンプル調製方法に対していくつかの改良点を実証した。
固体表面から切り離された液体油は、小さな液滴に乳化され、被用物の表面への再沈着を低減するために洗浄媒体中に十分に分散および懸濁することができる。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
北京農学部、原子力応用研究所(中国農学院)、北京林業大学生物研究センター、山金教授の多大な支援に感謝します。中国科学院動物学研究所の張。この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFD0600103)、中国自然科学財団(グラントNo.31570643、81774015)、中国の公共福祉における森林科学研究(201504304)、内モンゴルによって支援されました。農業大学ハイレベル人材研究立ち上げ計画(203206038)、内モンゴル自治区高等教育研究プロジェクト(NJZZ18047)、内モンゴル自治区臨行「ダブルファーストクラス」建設プロジェクト(170001)
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
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