原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング
Summary
液体試料からのエキソソームおよび細胞外小胞の標識フリー固定化および原子間力顕微鏡(AFM)によるイメージングに関するステップバイステップの手順について説明する。AFM画像は、溶液中の小胞のサイズを推定し、他の生物物理学的特性を特徴付けるために使用されます。
Abstract
エキソソームおよび他の細胞外小胞(EV)は、脂質膜小胞、膜タンパク質および他の分子による表面装飾、およびRNAを含む親細胞から受け継がれた多様な発光含有量からなる分子複合体であり、タンパク質、および DN。小胞の大きさや表面装飾によって形成される冠状層に依存するEVの流体力学的サイズの特性化は、日常化している。EVの最小であるエキソソームの場合、流体力学と小胞のサイズの相対的な差は重要です。低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングによる小胞サイズの特性解析は、金の標準的な技術であり、機器のコスト、サンプル調製、イメージングおよびおよびデータ分析、および画像で観察される粒子の数が少ない。広く利用可能でアクセス可能な代替手段は、原子力顕微鏡(AFM)であり、3次元幾何学、サイズ、および細胞外小胞の他の生物物理学的特性に関する多目的なデータを生成することができる。開発されたプロトコルは、この分析ツールを利用するユーザーを導き、水和または乾燥した形でEVをイメージングするためのサンプル準備を含むAFMによるEVの分析のためのワークフローを概説し、静電固定基板上の小胞、データ取得、分析、および解釈。代表的な結果は、変更されたマイカ表面上のEVの固定が予測可能でカスタマイズ可能であり、ユーザーが多数の小胞のサイジング結果を得ることを可能にすることを示しています。AFMデータに基づく小胞サイジングは、クライオ-TEMイメージングと一致することがわかった。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、血液、尿、唾液、牛乳、羊水を含むすべての体液に存在する。エキソソームは、エンドソーム生体形成、エンドソーム経路のマーカー、およびすべてのEVの中で最小サイズによって他のEVと区別されるEVの地区クラスを形成します。エキソソームの大きさは、多くの場合、研究間の実質的な変動で報告されます。サイジング結果は、EVサイズ1、2を推定する異なる分析技術によって採用される物理原理の違いを反映して、方法依存性であることが判明した。例えば、最も広く使用されているサイズ特性解析技術であるナノ粒子トラッキング解析(NTA)は、EVのサイズを流体力学的直径として推定し、溶液中のEVのブラウンモビリティに対する耐性を特徴付けます。小胞のより大きい流体力学の直径は液体の低い移動性を意味する。小胞の周りの冠状層は、表面タンパク質および膜表面に固定または吸着された他の分子からなる、実質的に移動性を阻害し、EVの流体力学的サイズを増加させる。相対的に見て、この増加は、図1に示すように、エキソソーム3に対して特に大きい。
低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングは、小胞の大きさと形態を水和状態で特徴付ける決定的な技術です。しかし、計測器のコストが高く、それを正しく使用するために必要な専門知識は、水和されたEVを画像化できる代替技術の探求を動機づけます。取得したクライオ-TEM画像で観測または特徴付けられた比較的少数のEVは、この技術のもう一つの顕著な欠点です。
原子力顕微鏡(AFM)は、水和または乾燥したEV4、5、6の3次元地形を可視化し、基板全体のプローブをスキャンして表面上の粒子の画像をラスター化する。本研究では、AFMによってEVを特徴付けるプロトコルの本質的なステップについて概説する。小胞を液体中で撮像する前に、機能性表面へのテザリング、フィルタ内の捕捉、または静電引き付け7によって基板上に固定化されなければならない。正に帯電した基板上の静電固定は、負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの固定化のための特に便利なオプションである。しかし、表面上の細胞外小胞を固定するのと同じ静電力もその形状を歪め、ポストイメージングデータ解析が不可欠です。この点を詳しく説明するには、表面に固定化されたエキソソームの歪んだ形状に関するAFMデータに基づいて、溶液中の球状小胞の大きさを推定するアルゴリズムを説明する。
開発されたプロトコルでは、小胞の堅牢な静電固定化の手順が提示され、水和または乾燥状態で原子力イメージングを実行するために必要な手順が続きます。固定化された小胞の表面濃度に影響を与える因子が同定される。このガイダンスは、溶液中のEV濃度が異なるサンプルに対して静電固定を実行する方法について説明します。十分に多数の固定化小胞に基づく異なる生物物理特性の経験的確率分布の推定を可能にする実験条件の選択が議論される。AFMデータのポストイメージング分析の例が示される。具体的には、固定化されたEVのAFM特性に基づいて溶液中の小胞の大きさを決定するためのアルゴリズムが記載されている。代表的な結果は、凍結TEMイメージングの結果とAFMによる小胞サイジングの一貫性を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体液からのEVの固定化、表面スキャン、画像解析は、液体中のEVのAFM特性解析のために開発されたプロトコルの重要なステップです。AFMイメージングに適した小胞の数は、画像化された表面積および基板上に固定化された小胞の表面濃度と共にスケールする。EVやエキソソーム18の負のゼータ電位を考えると、液体サンプルからAFM基板へのEVの静電固定を提唱する。固定化は…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、国立科学財団(賞番号IGERT-0903715)、ユタ大学(化学工学種子助成学科および大学院研究フェローシップ賞)、スコルコヴォ科学研究所からの財政的支援を認めています。と技術(スコルテックフェローシップ)。
Materials
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
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