혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩
Summary
새로운 혈관 형성 및 동 정적인 신경 분포 개장 하는 지방 조직에서 중추적인 역할을 재생합니다. 그러나, 시각화 및 양적 측정 지방 조직에 기술적인 문제가 남아 있다. 여기 우리는 성공적으로 레이블 및 양적 혈관과 다른 adipose 조직에 신경 섬유의 밀도 비교 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
최근 연구는 신생 및 비만의 발달 동안에 개장 하는 지방 조직에 동 정적인 신경 분포의 중요 한 역할을 강조 했습니다. 따라서, 지방 조직에서 동적인 변화를 문서화 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 개발은 필요입니다. 여기, 혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 효율적으로 공동 얼룩 수정된 immunofluorescent 방식을 설명 합니다. 전통 및 최근 개발 된 방법에 비해, 우리의 접근 방법 이며 비교적 따라 하기 쉬운 혈관 및 높은 밀도와 신경 섬유 및 더 적은 배경 라벨에 더 효율적. 또한, 추가 이미지의 높은 해상도를 수 있습니다 오픈 소스 소프트웨어에 의해 혈관, 분기, 및 섬유의 길이 영역을 정확 하 게 측정. 우리의 방법을 사용 하 여 데모, 우리는 그 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)의 혈관과 신경 섬유 흰색 adipose 조직 (WAT)에 비해 높은 금액을 포함 보여줍니다. 우리 찾기 시 켰 지, 중 피하 왓 (sWAT)는 혈관 및 신경 섬유 epididymal 와트 (eWAT)에 비해 더 더. 따라서 우리의 메서드는 지방 조직 리 모델링 조사에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다.
Introduction
지방 조직 변화 키 고 내 분 비 기능1. 그것은 동적으로 확장 하거나 축소 하는 다른에 대 한 응답 영양소 강조2. 과정을 개장 하는 활성 조직 구성 여러 생리 적 경로/단계 신생 혈관, 섬유 증, 지역 염증 성 microenvironments2,,34의 형성 등. 추위 노출, 운동, 등 일부 물리적 자극, 궁극적으로 새로운 혈관 형성 및 지방 조직5,6에 동 정적인 신경 분포에 이르게 공감 활성화, 실행할 수 있는. 이러한 리 모델링 프로세스 조직의 대사 결과 인슐린 감도, 유형 2 당뇨병2의 특징을 포함 하 여 밀접 하 게 연결 됩니다. 따라서, 이러한 병 적인 변화의 시각화 전체 adipose 조직의 건강 상태를 이해 하는 데 매우 중요 하다.
신생은 새로운 혈관 형성 과정입니다. 때문에 혈관 산소, 영양분, 호르몬, 및 조직에 성장 요소를 제공, 신생 다른 기법6,7, 로 문서화 되었습니다., 개장 하는 지방 조직에서 중요 한 단계 고려 되었습니다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 그러나 13., 거기 남아 있는 이미지의 해상도, immunostaining, 및 배 밀도의 정량화 방법의 효율성에 대 한 질문. 새로운 혈관 형성에 비해, 지방 조직에 신경 분포는 오랜 시간에 대 한 과소평가 되었습니다. 최근, 쩡 외입니다. 14 사용 고급 intravital 두 광자 현미경 그리고 시연 adipocytes14신경 섬유 층에 의해 포위 된다. 그 이후, 연구원은 지방 조직 생리학의 규칙에 동 정적인 신경 분포의 중추적인 역할을 감사 하기 시작 했습니다. 따라서, 문서 많은 신경 신경 분포 하는 간단 하 고 실용적인 접근 방식을 개발이 중요 합니다.
여기, 우리 보고 공동 혈관과 우리의 이전 프로토콜에 기반으로 하는 신경 섬유의 얼룩에 대 한 최적화 된 방법 합니다. 이 방법으로 우리 혈관과 신경 섬유 시끄러운 배경 없이 선명한 영상을 얻을 수 있습니다. 또한, 우리는 오픈 소스 소프트웨어와 밀도의 정량적 측정을 수행 하기 위해 충분히 높은 해상도 얻을. 이 새로운 접근법을 사용 하 여 우리가 성공적으로 구조와 혈관과 다른 많은 플랫폼에 신경 섬유의 밀도 비교할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지방 조직 리 모델링은 직접 연결할 대사 dysregulation 비만 개발1,2중. 신생 및 동 정적인 신경 분포는 모두 동적 개장 과정2,12필수 있습니다. 따라서 신경 섬유 뿐만 아니라 새로운 혈관을 시각화 하는 적용 가능한 접근을 개발은 매우 중요입니다. 이전 방법은 문서화 신생 지방 조직에 보고 되었습니다. 그러나,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 건강 (NIH) 부여 R01DK109001 (캔사스)의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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