التوصيل الكهربي لحمض γ-امينوفلودي (GABA) إلى تركيز الصرع يمنع النوبات في الفئران
Summary
التحدي المتمثل في البحث عن الصرع هو تطوير علاجات جديده للمرضي حيث العلاج الكلاسيكي غير كافيه. استخدام بروتوكول جديد-مع مساعده من نظام تسليم المخدرات القابلة للزرع-ونحن قادرون علي السيطرة علي المضبوطات في الفئران تخدير من قبل التسليم الكهربي من GABA في التركيز الصرع.
Abstract
الصرع هو مجموعه من الاضطرابات العصبية التي تصيب الملايين من الناس في جميع انحاء العالم. علي الرغم من ان العلاج مع الدواء مفيد في 70 ٪ من الحالات ، اثار جانبيه خطيره تؤثر علي نوعيه حياه المرضي. وعلاوة علي ذلك ، نسبه عاليه من مرضي الصرع هي مقاومه للادويه. في حالتهم ، جراحه المخ والأعصاب أو التحفيز العصبي ضرورية. ولذلك ، فان الهدف الرئيسي للبحوث الصرع هو اكتشاف العلاجات الجديدة التي هي اما قادره علي علاج الصرع دون اثار جانبيه أو منع المضبوطات المتكررة في المرضي المقاومين للادويه. وتوفر الهندسة العصبية نهجا جديده باستخدام استراتيجيات وتكنولوجيات مبتكره لإيجاد حلول أفضل لعلاج مرضي الصرع المعرضين للخطر.
كدليل علي البروتوكول التجريبي الجديد في نموذج ماوس حاد من الصرع ، يتم استخدام نظام توصيل الدواء الكهربي المباشر في الموقع. وهي, المسبار العصبية التي تتضمن مضخة أيون ميكروفلويدريك (Μفيب) لتسليم المخدرات عند الطلب والتسجيل المتزامن للنشاط العصبي المحلي مزروع وأظهرت ان تكون قادره علي السيطرة علي 4-aminopyridine-المستحثة (4AP-المستحثة) الاستيلاء مثل نشاط الحدث (SLE). يتم الاحتفاظ بتركيز حمض γ (GABA) في النطاق الفسيولوجي بالتحكم الدقيق في تسليم GABA للوصول إلى تاثير مضاد للصرع في تركيز النوبات ولكن ليس للتسبب في حدوث رشقات مرتده بسبب التثبيط المفرط. يسمح الأسلوب كلا من الكشف عن النشاط المرضي والتدخل لوقف المضبوطات عن طريق تقديم الناقلات العصبية المثبطة مباشره إلى تركيز الصرع مع التحكم المكاني الدقيق.
ونتيجة للتطورات التي طرات علي الطريقة التجريبية ، يمكن الحث علي SLEs بطريقه مترجمه للغاية تسمح بالسيطرة علي المضبوطات من خلال تسليم GABA مضبوط بدقه عند بداية النوبة.
Introduction
الصرع هو الاضطراب العصبي الرابع الأكثر شيوعا: حوالي 1 ٪ من السكان يعانون من الصرع ، وحوالي ثلث المصابين بنوبات متكررة. في معظم الحالات ، يمكن التحكم في النوبات بالادويه. ومع ذلك ، العلاج الدوائي يحتاج إلى تعيين لكل مريض علي حده ، حيث الجرعات المناسبة يمكن ان يستغرق سنوات للعثور علي1،2. بالاضافه إلى ذلك, معظم الدواء له اثار جانبيه خطيره التي تقلل من نوعيه الحياة3, 4,5,6,7. وأخيرا ، في 30 ٪ من الحالات المرضي مقاومه للادويه ، وفي حاله وجود مولد النوبات واحد ثابت ، فقط جراحه المخ والأعصاب المعدية يمكن ان تخفف من حدوث نوبات8. ولذلك ، فان المبادرة الرئيسية في أبحاث الصرع الحديثة هي اكتشاف استراتيجيات جديده يمكن ان تمنع النوبات المتكررة في المرضي المعرضين للخطر ، مع الحد من ضرورة العلاجات الدوائية القوية والجراحات الجراحية المعدية.
نوبات الصرع تحدث عندما يكون هناك خلل في الدوائر المثيرة والمثبطة اما في جميع انحاء الدماغ (الصرع المعمم) أو في جزء موضعي من الدماغ (الصرع البؤري), مثل ان الخلايا العصبية التفريغ بطريقه غير طبيعيه9 , 10 , 11. الادويه المضادة للصرع يمكن ان تعمل بطريقتين مختلفتين في الوقاية من المضبوطات: اما تقليل الاثاره أو تعزيز تثبيط12. علي وجه التحديد ، فانها يمكن اما تعديل النشاط الكهربائي للخلايا العصبية عن طريق التاثير علي قنوات أيون في غشاء الخلية13 أو القانون علي نقل المواد الكيميائية بين الخلايا العصبية عن طريق التاثير علي الناقل العصبي المثبط GABA أو مثير الغلوتامات في الاشتباكات العصبية14،15. بالنسبة لبعض الادويه ، فان طريقه العمل غير معروفه18. أيضا ، العلاجات الدوائية لها تاثير مستمر علي المرضي ولا يمكن التكيف مع ديناميات انتشار النوبات. ومن الناحية المثالية ، فان المخدرات مع أليات محدده للعمل تعمل علي عمليات الصرع الاساسيه. والعلاج الأمثل لا تلمس الدماغ البينية ولكن ستعمل علي الفور عندما يبدا النوبة النامية. وعلي النقيض من ذلك ، في جميع حالات الصرع ، يعني الدواء الآن العلاج المنهجي ، والتي تؤثر علي الدماغ كله والجسم كله من المريض9.
يمكن ان تظهر نوبات الصرع بعد سنوات عديده من الاهانه الاوليه مثل صدمه الدماغ. الفترة بين الاهانه الاوليه وحدوث النوبات العفوية الاولي تتميز باعاده تنظيمات جزيئيه وخلوية كبيره ، بما في ذلك موت الخلايا العصبية مع اختفاء اتصالات الشبكة العصبية و محواري sprouting/neosynaptogenesis مع ظهور اتصالات جديده19،20،21. وبمجرد ان تصبح المضبوطات متكررة ، يميل تواترها وشدتها إلى الزيادة ، بما يشمل مناطق أكثر من المخ. ومن المهم التمييز بين مواقع ظهور المضبوطات (المناطق الصرعة) من شبكات الانتشار ، حيث ان قواعد نشاه المضبوطات وانتشارها قد تختلف. وقد قدمت البحوث التي أجريت علي الانسجه البشرية والنماذج التجريبية من الصرع البيانات الهامه فيما يتعلق باعاده تنظيم الدوائر وقدرتها علي توليد المضبوطات20،21،22، 23-بيد انه من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه المنظمات هي ردود تكيف أو ما إذا كانت مرتبطة بالابيليبتوجينيسيس أو بنشاه المضبوطات والانتشار12.
ولذلك ، فان توطين تركيز الصرع وتطبيق الادويه المضادة للصرع محليا هي واحده من التحديات الرئيسية في أبحاث الصرع المعاصرة. العديد من التجارب باستخدام نماذج الحيوانية من الصرع وبعض الدراسات السريرية تهدف إلى العثور علي بداية الاحداث الاستيلاء وتحديد أليات الكامنة في الدماغ24,25,26,27. لهذا الغرض ، قمنا بتطوير بروتوكول تجريبي جديد باستخدام 4ap-الناجم عن الصرع نموذج28،29،30،31 في اعداد الماوس الحاد ، والذي يسمح بالادراج الدقيق لثلاثه الاجهزه في منطقه معينه من الحصين ، حيث يتم التلاعب بنشاط الشبكة في الجسم المجري بطريقه مترجمه للغاية. المترجمة 4AP حقن بواسطة ميكروماص الزجاج يساعد علي تحفيز SLEs الصرع في بقعه موضعيه في الحصين ، في حين مع مساعده من الرواية التي تستند إلى البوليمر Μفيب التحقيق السيطرة علي النشاط الاستيلاء يتحقق في وقت واحد عن طريق تسجيل الخلايا العصبية النشاط الكهربائي مع مواقع تسجيل الجهاز. ويرصد أيضا نشاط الحقل المحلي هيبوكامبال مع مسبار السيليكون متعدد القناات بطريقه محدده بطبقه في القشرة وفي الحصين في وقت واحد.
تعمل المجسات التي تم اختراعها مؤخرا باستخدام حقل كهربائي مطبق لدفع الادويه المشحونة المخزنة في قناه ميكروفلوريك عبر غشاء التبادل الأيوني (IEM) والي الانسجه المحيطة (الشكل 1). و IEM بشكل انتقائي ينقل نوع واحد فقط من أيون (الموجبة أو انيون) ، التالي ، يعمل علي الحد من انتشار السلبية في الدولة “قباله” ونقل الأنواع المشحونة معاكس من الانسجه المحيطة بها في الجهاز. يتم إنشاء الحقل الكهربائي علي الطلب عن طريق تطبيق الجهد الصغير (< 1 V) بين القطب المصدر الذي هو الداخلية إلى قناه ميكروفلويديك والقطب الهدف الذي هو خارجي للجهاز (في هذه الحالة ، المسمار الراس علي نموذج الحيوانية). معدل تسليم المخدرات يتناسب مع الجهد المطبق والتيار المقاسه بين المصدر والأقطاب المستهدفة. الدقة الدقيقة لتسليم المخدرات هي واحده من المزايا الرئيسية لل Μفيب. ميزه أخرى حرجه, بالمقارنة مع فلويديك أو الضغط القائم علي نظم إيصال المخدرات, هو انه في μفيب هناك فقط زيادة الضغط لا يكاد يذكر في منفذ تسليم المخدرات كما يتم تسليم الادويه عبر iem دون حل الناقل.
هناك كميه صغيره من تسرب السلبي من GABA عندما Μفيب هو “إيقاف”, ولكن تم العثور علي هذا لا للتاثير SLEs. و Μفيب هي مخصصه الصنع التالية أساليب التصنيع المجهري التقليدية التي ذكرناها سابقا31.
وبما ان أحدي طرق منع النوبات المتكررة هي الحصار المفروض علي تصريف الشبكات في البداية أو حتى قبل الحدث الأول للمصادرة ، فان الطريقة المعروضة لتقديم الناقل العصبي المثبط GABA إلى تركيز الصرع لها عظيم المحتملة العلاجية للسيطرة علي المضبوطات في المرضي الذين يعانون من الصرع البؤري. منذ GABA هو الركيزة الذاتية, فانه يترك خصائص الخلايا العصبية المتاصله دون تغيير في تركيزات الفسيولوجية. التطبيق المحلي لمستويات منخفضه من GABA سوف تؤثر فقط علي الخلايا التي تستجيب بشكل طبيعي لتثبيط, وسوف يسبب فقط اثار مماثله لتثبيط الفسيولوجية, خلافا لتحفيز الدماغ العميق (بي بي اس), التي لديها إجراءات غير محدده من خلال تحفيز جميع الخلايا من الشبكة العصبية في بيئتها ، مما تسبب في استجابه مختلطة تنطوي علي كل من الاثاره وتثبيط. وفي الختام ، فان الطريقة المقترحة توفر نهجا أكثر تحديدا للسيطرة علي المضبوطات من الاداره العامة.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال تطوير بروتوكول تجريبي جديد في نموذج ماوس حاد من الصرع ، يمكن السيطرة علي SLEs بنجاح مع مساعده من Μفيب مزروع في تركيز الصرع. بفضل قدرتها علي تقديم GABA مع الدقة الزمانيه والمكانية, تم التحكم في SLEs المستحثة 4AP في بداية المضبوطات. علاج الصرع ممكن نظريا إذا تم تحقيق السيطرة علي تصريف الشبكة ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتعترف C.M.P. بالتمويل المقدم من منحه من الباحثين الدوليين في ويتاكر يديرها معهد التعليم الدولي. وقد رعت A.K. ماري كوري IEF (No. 625372). وتعترف الA.W. بالتمويل المقدم من المجلس الأوروبي للبحوث في اطار برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار 2020 (الاتفاق الخاص بالمنح رقم 716867). وتعترف A.W. بالاضافه إلى ذلك بمبادرة التميز التي أطلقتها جامعه ايكس مرسيليا-A * MIDEX ، وهي برنامج فرنسي “إينفيستيسيمينتس d’Avenir”. ويعترف المؤلفون بالدكتور ايلكي اوغوز ، والدكتور سيكا نال ، والدكتور فينسينزو كورستو ، والدكتورة ماري دوناهو ، والدكتور مارك فيرو ، وزسوفيا ماغلوسكي لمشاركتهم في مناقشات مثمرة.
Materials
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Narishige | GJ-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neurosciences. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J. Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (1), 3-14 (2005).
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B. Ictal Interictal Continuum Patterns. Current Treatment Options in Neurology. 20 (5), 15 (2018).
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
