La entrega electroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) en el enfoque epiléptico previene las convulsiones en ratones

Summary

El reto de la investigación de la epilepsia es desarrollar tratamientos novedosos para los pacientes donde la terapia clásica es inadecuada. El uso de un nuevo protocolo — con la ayuda de un sistema de administración de fármacos implantables — somos capaces de controlar las convulsiones en ratones anestesiados por la entrega electroforética de GABA en el foco epiléptico.

Abstract

La epilepsia es un grupo de trastornos neurológicos que afecta a millones de personas en todo el mundo. Aunque el tratamiento con medicamentos es útil en el 70% de los casos, los efectos secundarios graves afectan la calidad de vida de los pacientes. Por otra parte, un alto porcentaje de pacientes epilépticos son farmacorresistentes; en su caso, se necesita neurocirugía o neuroestimulación. Por lo tanto, el objetivo principal de la investigación de la epilepsia es descubrir nuevas terapias que sean capaces de curar la epilepsia sin efectos secundarios o prevenir convulsiones recurrentes en pacientes farmacorresistentes. La neuroingeniería proporciona nuevos enfoques mediante el uso de nuevas estrategias y tecnologías para encontrar mejores soluciones para curar a los pacientes epilépticos en riesgo.

Como demostración de un novedoso protocolo experimental en un modelo agudo de ratón de epilepsia, se utiliza un sistema de administración de fármacos electroforéticos directos in situ. Es decir, una sonda neuronal que incorpora una bomba de iones de microfluidos (μFIP) para la entrega de fármacos bajo demanda y la grabación simultánea de la actividad neuronal local se implanta y se demuestra que es capaz de controlar las convulsiones inducidas por 4-aminopyridina (inducida por 4AP) como actividad del evento (SLE). La concentración de ácido γ-aminobutírico (GABA) se mantiene en el rango fisiológico por el control preciso de la entrega de GABA para alcanzar un efecto antiepiléptico en el foco de convulsiones pero no causar explosiones de rebote inducida por sobreinhibición. El método permite tanto la detección de la actividad patológica como la intervención para detener las convulsiones mediante la entrega de neurotransmisores inhibitorios directamente al foco epiléptico con control espaciotemporal preciso.

Como resultado de los desarrollos para el método experimental, SLEs se puede inducir de una manera altamente localizada que permite el control de las convulsiones por la entrega de GABA afinado con precisión en el inicio de la convulsión.

Introduction

La epilepsia es el cuarto trastorno neurológico más común: alrededor del 1% de la población sufre de epilepsia, y alrededor de un tercio de los afectados presentan convulsiones recurrentes. En la mayoría de los casos, las convulsiones se pueden controlar con medicamentos. Sin embargo, el tratamiento farmacológico debe establecerse para cada paciente individualmente, donde la dosificación adecuada puede tomar años para encontrar^1,2. Además, la mayoría de los medicamentos tiene efectos secundarios graves que reducen la calidad de vida^3,4,5,6,7. Por último, en el 30% de los casos los pacientes son resistentes a la medicación, y en el caso de un locus único generador de convulsiones, sólo la neurocirugía resectiva puede atenuar la ocurrencia de convulsiones⁸. Por lo tanto, una iniciativa importante en la investigación de la epilepsia moderna es descubrir nuevas estrategias que pueden prevenir las convulsiones recurrentes en pacientes en riesgo, reduciendo la necesidad de terapias farmacológicas fuertes y cirugías resectivas invasivas.

Las convulsiones epilépticas ocurren cuando hay un desequilibrio dentro de los circuitos excitatorios e inhibitorios en todo el cerebro (epilepsia generalizada) o en una parte localizada del cerebro (epilepsia focal), de tal manera que las neuronas se descargan de forma anormal^{9 , 10 , 11}. los fármacos antiepilépticos pueden actuar de dos maneras diferentes en la prevención de convulsiones: disminución de la excitación o aumento de la inhibición¹². Específicamente, pueden o bien modificar la actividad eléctrica de las células neuronales afectando a los canales de iones en la membrana celular¹³ o actuar sobre la transmisión química entre las neuronas al afectar el neurotransmisor inhibitorio GABA o el excitatorio glutamato en las sinapsis^14,15. Para algunos medicamentos, el modo de acción es desconocido¹⁸. Además, los tratamientos farmacológico tienen un efecto continuo en los pacientes y no pueden adaptarse a la dinámica de prevalencia de las convulsiones. Idealmente, los fármacos con mecanismos específicos de acción actuarían sobre los procesos epilépticos subyacentes. Un tratamiento óptimo no tocaría el cerebro interictally pero actuaría inmediatamente cuando una convulsión empiece a desarrollarse. En contraste con eso, en todos los casos de epilepsia, la medicación ahora significa un tratamiento sistemático, afectando todo el cerebro y todo el cuerpo del paciente⁹.

Las convulsiones epilépticas pueden aparecer muchos años después del insulto inicial, como el trauma cerebral. El período entre el insulto inicial y la ocurrencia de las primeras convulsiones espontáneas se caracteriza por considerables reorganizaciones moleculares y celulares, incluyendo la muerte neuronal con la desaparición de las conexiones de red neuronal y axonal brotación/neosinaptogénesis con la aparición de nuevas conexiones^19,20,21. Una vez que las convulsiones se vuelven recurrentes, su frecuencia y severidad tienden a aumentar, involucrando más regiones cerebrales. Es importante distinguir los sitios de aparición de convulsiones (regiones epileptogénicas) de las redes de propagación, ya que las normas de la génesis y la propagación de las convulsiones pueden diferir. Las investigaciones realizadas sobre el tejido humano y los modelos experimentales de epilepsia han proporcionado datos importantes sobre la reorganización de los circuitos y su capacidad para generar convulsiones^{20,21,22, 23}. sin embargo, es difícil determinar si estas reorganizaciones son respuestas adaptativas o si están relacionadas causalmente con la epileptogénesis o el embargo Génesis y la propagación¹².

Por lo tanto, localizar el enfoque epiléptico y la aplicación de fármacos antiepilépticos localmente son uno de los principales desafíos en la investigación de la epilepsia contemporánea. Varios experimentos con modelos animales de epilepsia y algunos estudios clínicos apuntan a encontrar la aparición de los eventos convulsivos y definir los mecanismos subyacentes en el cerebro^24,25,26,27. Con este fin, desarrollamos un nuevo protocolo experimental utilizando el modelo de epilepsia inducida por 4AP²⁸,^29,30,31 en una preparación aguda del ratón, que permite la inserción precisa de tres dispositivos en el área dada del hipocampo, donde la actividad de la red in vivo se manipula de una manera altamente localizada. La inyección localizada de 4AP por una micropipeta de vidrio ayuda a inducir los SLEs epilépticos en un lugar localizado en el hipocampo, mientras que con la ayuda de la nueva sonda μFIP basada en polímeros, el control de la actividad convulsiva se logra simultáneamente registrando el actividad eléctrica con los sitios de grabación del dispositivo. La actividad de campo local hippocampal también se supervisa con una sonda de silicio multicanal de una manera específica de la capa en la corteza y en el hipocampo simultáneamente.

Las sondas μFIP recientemente inventadas funcionan mediante el uso de un campo eléctrico aplicado para empujar los fármacos cargados almacenados en un canal de microfluidos a través de una membrana de intercambio de iones (IEM) y hacia el tejido circundante (figura 1). El IEM transporta selectivamente sólo un tipo de iones (cationes o aniones) y, por lo tanto, trabaja para limitar la difusión pasiva en el estado “apagado” y el transporte de especies cargadas de forma opuesta del tejido circundante al dispositivo. El campo eléctrico se crea bajo demanda aplicando un pequeño voltaje (< 1 V) entre el electrodo de origen que es interno al canal de microfluidos y un electrodo de destino que es externo al dispositivo (en este caso, el tornillo de cabeza en el modelo animal). La tasa de entrega de fármacos es proporcional a la tensión aplicada y la corriente medida entre los electrodos de origen y de destino. La tunabilidad precisa de la administración de fármacos es una de las principales ventajas de la μFIP. Otra ventaja crítica, en comparación con los sistemas de administración de fármacos a base de fluidos o de presión, es que en el μFIP sólo hay un aumento de presión insignificante en la salida de suministro de fármacos, ya que los fármacos se entregan a través del IEM sin su solución portadora.

Hay una pequeña cantidad de fuga pasiva de GABA cuando el μFIP es “apagado”, pero esto fue encontrado para no efecto SLEs. Los μFIP son hechos a medida siguiendo los métodos convencionales de microfabricación que hemos reportado anteriormente³¹.

Dado que una manera de prevenir las convulsiones recurrentes es el bloqueo de las descargas de la red en el principio o incluso antes del primer evento convulsivo, el método presentado para entregar el neurotransmisor inhibitorio GABA en el enfoque epiléptico tiene gran potencial terapéutico para el control de las convulsiones en pacientes con epilepsia focal. Puesto que el GABA es un sustrato endógeno, deja propiedades neuronales intrínsecas sin cambios en las concentraciones fisiológicas. La aplicación local de bajos niveles de GABA sólo afectará a las células naturalmente sensibles a la inhibición, y sólo causará efectos similares a la inhibición fisiológica, contrariamente a la estimulación cerebral profunda (DBS), que tiene acciones inespecíficas estimulando todas las células de la red neuronal en su entorno, causando una respuesta mixta que involucra tanto la excitación como la inhibición. En conclusión, el método propuesto proporciona un enfoque más específico para el control de las convulsiones que el DBS.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices éticas del Institut de NEUROSCIENCES des Systèmes y aprobados por los comités éticos y las oficinas veterinarias locales. Nota: Diecisiete ratones masculinos adultos of1 fueron utilizados para los experimentos. Ratones fueron atrapados a un 12 h ciclo de luz/oscuridad con alimentos y agua disponible ad libitum. 1. anestesia Inyectar intraperit…

Representative Results

Utilizando el procedimiento presentado aquí con un modelo de epilepsia 4AP en ratones anestesiados, el control de las convulsiones epilépticas se puede lograr en el enfoque epiléptico. La localización precisa de los implantes (figura 2) ayudó a registrar potenciales de campo local hipocampal (LFPs, figura 4), para inducir pequeñas convulsiones hipocampales y para entregar GABA en el inicio de la convulsión. La localizació…

Discussion

Mediante el desarrollo de un nuevo protocolo experimental en un modelo agudo de ratón de la epilepsia, SLEs podría ser controlado con éxito con la ayuda de un μFIP implantado en el foco epiléptico. Gracias a su capacidad para entregar GABA con precisión temporal y espacial, SLEs inducida por 4AP fueron controlados en el inicio de las convulsiones. El tratamiento de la epilepsia es teóricamente posible si se logra el control de las descargas de la red neuronal en el lugar del inicio de la convulsión. El protocolo …

Materials

4AP	Sigma	275875
Alexa Fluor 488	Abcam	ab15007
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Borosilica glass pipette	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Bone trimmer	FST	16109-14
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Connector	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Cover slip	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Drill	FOREDOM	K1070
Forceps	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GFAP Monoclonal Antibody	Thermofisher	53-9892-80
GOPS	Sigma	440167-100M
Hamilton seringe	Hamilton	80330
Headscrew	Component Supply	TX00-2FH
Heating pad	Harvard apparatus	341446
Injection Pump	WPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Ketamine	Renaudin	5787419
Magnetic holder	Narishige	GJ-1
Mice	Charles River	612
Motoric manipulator	Scientifica, UK	IVM
Na2HPO4	Sigma	255793
NaH2PO4	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Paper towel	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT:PSS	CLEVIOS	81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Rectal temperature probe	Harvard apparatus	521591
Ropivacaine	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST R195806
Seringue	BD Medical	324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 is recommended
Silicon probe	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703
Stereotoxic frame	Stoelting	51733U
Superfrost Slide	ThermoScientific	J38000AMNZ
Tubing	INSTECH	LS20
Vaseline	Laboratoire Gilbert	3518646126611
Vectashield DAPI	Vector Laboratories, California, USA	H-1200-10
Vibratome, Leica VT1200S	Leica Microsystems	1491200S001
Xylazine	Bayer	4007221032311