Denne protokol viser analyse af mitokondriel respiratorisk kæde komplekser af blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese. Her er metoden anvendt til dyrkede humane celler beskrevet.
Mitokondrie respiration er udført af oxidativ fosforylering (OXPHOS) komplekser i mitokondrierne. Interne og miljømæssige faktorer kan forurolige forsamling og stabiliteten af OXPHOS komplekser. Denne protokol beskriver analyse af mitokondriel respiratorisk kæde komplekser af blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) i ansøgningen til dyrkede humane celler. Første mitokondrier er udvundet fra celler ved hjælp af digitonin, så brug lauryl maltoside, de intakte OXPHOS komplekser er isoleret fra mitokondrie membraner. OXPHOS komplekser er så løst af gradient gelelektroforese under tilstedeværelse af den negativt ladede farvestof, Coomassie blå, som forhindrer protein sammenlægning og sikrer elektroforese mobilitet af proteinkomplekser mod katoden. Endelig er OXPHOS komplekser fundet af standard immunoblotting. Således er BN-side en praktisk og billig teknik, der kan bruges til at evaluere forsamlingen af hele OXPHOS komplekser, i modsætning til den grundlæggende SDS-PAGE giver mulighed for undersøgelse af kun enkelte OXPHOS komplekse underenheder.
Mitokondrier er multifunktionelle organeller spiller en vigtig rolle i energiproduktionen, regulering af cellulære metabolisme, signalering apoptose, aldring, etc.1,2,3. Energiproduktion i mitokondrier er afhængig af funktionen oxidativ fosforylering, at par respiration med ATPsyntesen. I humane celler består mitokondrie oxidativ fosforylering system (OXPHOS) af fem komplekser. Komplekser I-IV opretter en elektrokemisk proton forløb i den mitokondrielle intermembrane plads, der bruges af komplekse V til at producere ATP. Hver OXPHOS komplekse er multimeriske og undtagen komplekse II, der består af underenheder kodet af nukleare og mitokondrie gener. Eventuelle fejl i de centrale komponenter i OXPHOS komplekser forårsaget af mutationer eller miljømæssige stress kan forurolige forsamling og funktionalitet af oxidativ fosforylering system. Derudover kræver ordentlig samling af funktionelle OXPHOS komplekser et stort antal forsamling faktorer4,5,6.
Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en grundlæggende teknik muliggør analyse af intakt proteinkomplekser og kan bruges til at studere forsamlingen af OXPHOS komplekser. Først, mitokondrier er isoleret fra cellerne af digitonin, som er et mildt rengøringsmiddel, der permeabilizes plasmamembran i cellerne. Derefter, ved hjælp af lauryl maltoside, OXPHOS komplekser er frigivet fra mitokondrie membraner. Ved hjælp af gradient gelelektroforese, er OXPHOS komplekser adskilt efter deres masse. Coomassie blå G-250 (ikke R-250) tilføjet til prøvebuffer og blå katode buffer dissocieres vaskemiddel-labil foreninger men bevarer individuelle respiratorisk kæde komplekser intakt8. Under elektroforese, er blå katode bufferen indeholder farvestof erstattet af katode buffer uden farvestof, som sikrer effektiv overførsel af OXPHOS komplekser til PVDF membran8. For at visualisere OXPHOS komplekser, inkuberes PVDF membran sekventielt med antistoffer svarende til de valgte underenheder af de fem OXPHOS komplekser.
Metoden beskrevet her med nogle ændringer kan anvendes på enhver kulturperler celler. Desuden, kan denne metode bruges til analyse af OXPHOS komplekser i mitokondrierne isoleres fra væv prøver9. BN-side kræver mindst 5-10 µg af mitochondrier for hver prøve pr. løb. Ved hjælp af metoden beskrevet her, 500.000 kulturperler celler såsom HEK293, SH-SY5Y eller 143B celler kan give ca 10 µg af mitokondrier. En tilstrækkelig mængde af celler til analysen af BN afhænger imidlertid bestemt celletype.
Den mest almindelige metode til at studere mitokondrie OXPHOS proteiner er SDS-PAGE og western blotting. Men, SDS-PAGE giver mulighed for at studere kun enkelte OXPHOS underenheder, og i modsætning til mia-side, kan ikke bruges til at evaluere forsamlingen af hele OXPHOS komplekser. Klart native-side adskiller proteinkomplekser i native betingelser uden tilstedeværelse af negativt ladede farvestof og har en betydeligt lavere opløsning i forhold til mia-side. Dog er klart indfødte-side mildere end BN-side, så det kan bevare labile Supramolekylær forsamlinger af proteinkomplekser såsom OXPHOS supercomplexes, der dissocieres under BN-side betingelser10. I denne protokol bruges den gradient gel til at adskille komplekser; men alternativt, ikke-gradient adskillelse kan bruges hvis det relativt dyre gradient maker ikke er tilgængelige11.
Vigtigt, metoden beskrevet her kan analysere forsamlingen af OXPHOS komplekser, mens funktionaliteten af komplekser ikke er vurderet. En høj opløsning BN-side efterfulgt af i-gel aktivitet assay11 samt spektrofotometriske enzymatisk aktivitet assay af mitokondrie komplekser12 er effektive teknikker til funktionel analyse af OXPHOS komplekser. Begge disse metoder imidlertid ikke assay samling af OXPHOS komplekser.
BN-side er således den optimale metode til at undersøge forsamlingen af individuelle OXPHOS komplekser. For eksempel, er nogle Mitokondrie-sygdomme, såsom Leber arvelige optisk neuropati (LHON), mitokondrie encephalopati med mælkesyre acidose og slagtilfælde-lignende episoder (MELAS), forbundet med ændrede forsamling af en eller flere komponenter i OXPHOS system5. Ved hjælp af BN-side metoden beskrevet her, kan blive undersøgt de molekylære mekanismer af mitokondrie sygdomme.
En af de mest kritiske dele af protokollen er at bevare intakt OXPHOS komplekser under prøveforberedelse, opbevaring og gel elektroforese. Således skal holdes isoleret ved + 4 ° C, mitokondrier og prøverne underkastes ikke fryse-tø cykler. OXPHOS komplekser kan kun tåle en fryse-tø cyklus under hele proceduren. Flere fryse-tø cykler ødelægge OXPHOS komplekser (figur 1B). Kontrol og eksperimentelle prøver, der skal sammenlignes skal udarbejdes sideløbende at undgå eventuelle forskelle i vilkårene for opbevaring, som kan give misvisende resultater. Hvis det ikke er muligt at udføre alle trinene i protokollen parallelt med alle prøverne, anbefaler vi at fryse vasket celle pellets ved-80 ° C (trin 1.4 i denne protokol) og senere udføre resten af protokollen til alle prøver sammen i det mindste indtil gel elec trophoresis. Særlig opmærksomhed bør betales til renholdelse af elektroforese apparater (tank, kassette). Hvis samme apparat bruges til SDS-PAGE, vaske det meget godt før BN-side. Eventuelle resterende SDS kan forårsage dissociation af OXPHOS komplekser under elektroforese.
Høj kvalitet gradient geler er en anden vigtig del af protokollen. Færdigstøbte gel til blå indfødte side er kommercielt tilgængelige; Det anbefales dog ikke at bruge dem, da de buffere anvendes til kommercielle geler kan have en sammensætning, der er forskellig fra prøve buffere. Graduering af gel bruges her (6-15%) er optimal for adskillelse af enkelte OXPHOS komplekser. For at registrere højere-ordens Supramolekylær strukturer af OXPHOS, også kendt som respiratorisk kæde supercomplexes14, er nogle optimering nødvendig11.
For visualisering af OXPHOS brug komplekser af specifikke antistoffer sekventielt, baseret på deres egenskaber. For eksempel Brug først det antistof, der giver de svageste signal og antistof med det stærkeste signal sidst. Det er vigtigt, eftersom den stripping svækker påvisning (fig. 1 d). Sammensætningen af respiratorisk kæde komplekser kan undersøges, hvis efter BN-side gelen er udsat for den anden dimension SDS-PAGE15.
Protokollen beskrevet her foreslår at bruge antistoffer mod individuelle OXPHOS komplekser sekventielt. Men de kommercielt tilgængelige OXPHOS antistof cocktail kan bruges til at registrere alle fem OXPHOS komplekser samtidigt. Ikke desto mindre, for at være i stand til at opdage ufuldstændigt forsamlede OXPHOS komplekser og definere deres identitet, antistoffer mod individuelle OXPHOS komplekser bør anvendes sekventielt. Dette trin er tidskrævende; Det kan imidlertid være afgørende for afprøvning af nye eksperimentelle betingelser og modeller.
Koncentrationen af digitonin anvendes til mitokondrie isolation skal optimeres til specifikke celletype. Som et vaskemiddel permeabilizes digitonin celle membraner. Den optimale koncentration af digitonin permeabilizes effektivt plasmamembran i cellerne forlader mitokondrie membraner intakt. For lav koncentration af digitonin forårsager høj forurening af mitokondrie uddrag, mens alt for høj koncentration til skade mitokondrie membraner og reducerer de samlede mitokondrie udbytte. Optimal digitonin/protein-forhold (g/g) varierer fra 0,3 til 1. Western blot analyse af proteiner udvundet fra pellets og analysere kan bruges til at teste den optimale koncentration af digitonin16.
Denne protokol omfatter ikke protein lastning kontrol på immunblot; Derfor bør proteinkoncentration af uddraget komplekser omhyggeligt måles mindst i tre sikre lige lastning. Derudover kan prøver køres i mia-side i replikater. Hvis samling af selektiv OXPHOS komplekser er nedsat, upåvirket komplekser kan tjene som lastning kontrol.
Estimering af proteinkomplekser i siden BN molekylvægt er udfordrende18. Den nuværende protokol omfatter ikke molekylvægt markør; Derfor, for at anslå forsamlingen af OXPHOS komplekser, kontrolprøver indeholdende upåvirket komplekser bør altid indgå i analysen. Kontrolprøver for BN-side er normalt ubehandlet eller vilde type celler.
Den metode, der præsenteres her er optimeret til påvisning af mitokondrie respiratorisk kæde komplekser; Det kan imidlertid også anvendes til evaluering af oligomerisering af mitokondrielle proteiner19. Derudover kan forsamling satsen for OXPHOS komplekser studeres ved første ozonnedbrydende mitokondrie-kodet subunit indeholdende komplekser af chloramphenicol og derefter efter deres bedring efter fjernelse af chloramphenicol10. BN-side kan således bruges til at evaluere steady state niveauer og montering af OXPHOS til forskellige anvendelser, herunder Molekylær diagnostik af menneskelige Mitokondrie-sygdomme9,11.
The authors have nothing to disclose.
Helsinki University Library er takkede for den finansielle støtte i udgivelse.
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |