Summary

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

Published: February 23, 2019
doi:

Summary

التنفس المتقدرية أمر حاسم لبقاء العضوي؛ ولذلك، معدل استهلاك الأوكسجين مؤشرا ممتازا للصحة المتقدرية. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف استخدام ريسبيروميتير المتاحة تجارياً لقياس القاعدية ومعدلات استهلاك الأوكسجين القصوى في العيش، سليمة، وبحرية متحركة ايليجانس كاينورهابديتيس.

Abstract

الوظيفة المتقدرية الأمثل حاسم بالنسبة للنشاط الخلوي صحية، خاصة في الخلايا التي تحتوي على متطلبات الطاقة العالية مثل تلك الموجودة في الجهاز العصبي والعضلات. يتفق مع هذا، ارتبط خلل mitochondrial بعدد وافر من أمراض الأعصاب والشيخوخة بشكل عام. وقد ايليجانس كاينورهابديتيس نظام نموذجي قوية لتوضيح تعقيدات كثيرة للوظيفة المتقدرية. التنفس المتقدرية يعد مؤشرا قويا للوظيفة المتقدرية ووضعت مؤخرا ريسبيروميتيرس منهاجا الدولة للفنون لقياس التنفس في الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم تقنية لتحليل سليمة، والعيش C. ايليجانس. هذا البروتوكول يمتد لفترة ~ 7 أيام ويتضمن خطوات لتنمو وتزامن C. ايليجانس، (2) إعداد المركبات بالحقن وترطيب المسابير، (3) المخدرات خرطوشة وتحميل الموازنة، (4) إعداد المقايسة دودة (1) لوحة والمقايسة تشغيل، وتحليل البيانات بعد التجربة (5).

Introduction

وتنتج الإنزيمات في سلسلة نقل الإلكترون (إلخ) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، المصدر الرئيسي للطاقة الخلوية، في الميتوكوندريا. بيروفات، المستقلب رئيسية المستخدمة لإنتاج ATP المتقدرية، يتم استيراده في المصفوفة الميتوكوندريا حيث أنها ديكاربوكسيلاتيد لإنتاج أسيتيل مرافق إنزيم أ (CoA). وبعد ذلك، يدخل أسيتيل CoA دورة حمض الستريك أدى إلى توليد نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH)، جزيء إلكترون رئيسية الناقل. كما يتم تمرير الإلكترونات من NADH إلى الأوكسجين عبر إلخ، والبروتونات بناء في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى توليد التدرج الكهروكيميائية عبر الغشاء. ثم ستتدفق هذه البروتونات من الفضاء intermembrane عبر هذا التدرج الكهروكيميائية العودة إلى المصفوفة المتقدرية عن طريق المسام بروتون من synthase ATP، القيادة التناوب وتركيب ATP1 (الشكل 1).

الوظيفة المتقدرية لا يقتصر على إنتاج الطاقة ولكن أيضا أمر حاسم لاستتباب الكالسيوم والأكسجين التفاعلية الأنواع (روس) المسح والمبرمج، حاسمة لتحديد المواقع وظيفتها في الصحة العضوي2. ويمكن تقييم الوظيفة المتقدرية باستخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، التحليلات التي تقيس غشاء الميتوكوندريا المحتملة ومستويات ATP وروس، وتركيزات الكالسيوم المتقدرية. بيد أن هذه الاختبارات توفر لقطة واحدة من الوظيفة المتقدرية ولذلك قد لا يوفر نظرة شاملة لصحة المتقدرية. نظراً لاستهلاك الأوكسجين أثناء توليد ATP يعتمد على عدد وافر تفاعلات متسلسلة، هو بمثابة مؤشر متفوقة من الوظيفة المتقدرية. من المثير للاهتمام، وقد لوحظت اختلافات في معدلات استهلاك الأوكسجين نتيجة خلل mitochondrial3،،من45.

ويمكن قياس معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) للعينات الحية باستخدام التقنيات التي يمكن تقسيم إلى مجموعتين: أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار وفوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي يمكن أن تطفئ بالأكسجين6. وقد استخدمت على نطاق واسع أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار لتدبير التعرف الضوئي على الحروف في استزراع الخلايا، الأنسجة، وفي نظم نموذجية، مثل C. ايليجانس. ومع ذلك، تمتلك فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحتوي على ريسبيروميتيرس بالمزايا التالية: (1) أنها تسمح بإجراء مقارنة جنبا إلى جنب من عينتين في ثلاث نسخ، (2) أنها تتطلب حجم عينة أصغر (مثل الديدان 20 كل بئر مقابل ~ 2، 000−5، 000 الديدان الدائرة)7، و (3) ريسبيروميتير يمكن برمجتها للقيام بأربع حقن مركبة مختلفة في المطلوب مرات في جميع أنحاء تشغيل تجريبي، مما يلغي الحاجة للتطبيق اليدوي.

في هذا البروتوكول، وهي الخطوات المتضمنة في استخدام ريسبيروميتير الاستشعار الأوكسجين البورفيرين المستندة إلى تدبير التعرف الضوئي على الحروف في العيش، سليمة C. ايليجانس وصف. بينما هناك بروتوكول مكتوب لاستخدام بشكل كبير، الإنتاجية العالية ريسبيروميتير8، تم تكييفها للاستخدام مع أداة ودية وسهلة المنال، وأصغر من حجم ميزانية أكثر هذا البروتوكول. هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص لتقييم الفرق بين السلالات اثنين، حيث الفرز الفائق غير مطلوب وسيكون استعماله المفرط في التعرف الضوئي على الحروف.

Protocol

ملاحظة: الرقم 2 لمحة تخطيطي للبروتوكول بالكامل. 1-النمو والمزامنة من السكان السلكية9،10 نقل اليرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة (مثلاً، N2 [نوع البرية] والحيوانات sel-12) على لوحات وسائل الإعلام (NGM) نمو السلكية (انظر ال…

Representative Results

استخدام البروتوكول الموضحة هنا، التعرف الضوئي على الحروف من الحيوانات البرية نوع وثلاثة مختلفة sel-12 المسخ تم تحديد سلالات. بترميز sel-12 أورثولوج C. ايليجانس presenilin17. الطفرات في بريسينيلين البشرية هي انحراف الوراثية الأكثر شيوعاً المقترنة بتطوير …

Discussion

التنفس المتقدرية مؤشرا الثاقبة من الوظيفة المتقدرية؛ ولذلك، أن تكون قادرة على قياس معدلات استهلاك الأكسجين في نظام البيولوجي، سواء في المختبر أو في الحية قيمة للغاية. بمعنى ريسبيروميتيرس مستويات الأوكسجين باستخدام فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحصل على مروي بالأكسجين أو عن طري…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب يود أن ينوه الدكتور كيفين Bittman لقيادته في إنشاء XFp فرس البحر في المختبر. المعاهد الوطنية “للصحة” منح GM088213 تؤيد هذا العمل.

Materials

100 mm, 60 mm Petri dishes Kord-Valmark Labware Products 2900, 2901
1.5 mL centrifuge tubes Globe Scientific 6285
15 mL conical tubes Corning 430791
22 × 22 mm coverslip Globe Scientific 1404-10
50 mL conical tubes Corning 430829
Agar Fisher Scientific BP1423-2
Bacto peptone BD, Bacto 211677
Bacto tryptone BD, Bacto 211705
Bacto yeast extract BD, Bacto 212705
Bleach Generic
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Fisher Scientific C79-500
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Abcam ab120081
Cholesterol Fisher Scientific C314-500
Deionized water (dH2O)
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Thomas Scientific C987Y85
Glass Pasteur pipettes Krackeler Scientific 6-72050-900
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) Fisher Scientific BP213-1
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific BP359-500
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-1
Seahorse XFp Analyzer Agilent
Seahorse XFp FluxPak Agilent 103022-100
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002

References

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
  3. Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
  4. Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
  5. Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
  6. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
  7. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
  8. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
  9. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
  10. Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
  12. Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
  13. Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
  14. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
  15. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
  16. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
  17. Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
  18. Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
  19. Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochimie. 51, 2959-2973 (2012).
  20. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Génétique. 201, 1453-1466 (2015).
check_url/fr/59277?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (144), e59277, doi:10.3791/59277 (2019).

View Video