अक्षुण्ण केनोहाब्दितिस एलीगेंस में ऑक्सीजन उपभोग दरों का मापन
Summary
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है; इसलिए, ऑक्सीजन की खपत की दर माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का एक उत्कृष्ट संकेतक है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आत्मशोधन का उपयोग करने के लिए बेसल और अधिकतम ऑक्सीजन की खपत दरों में रहते हैं, बरकरार है, और स्वतंत्र रूप से-gram caenorhabditis एलिगेंसउपाय का वर्णन ।
Abstract
इष्टतम माइटोकॉन्ड्रियल समारोह स्वस्थ सेलुलर गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से कोशिकाओं में जो तंत्रिका तंत्र और मांसपेशी में उन जैसे उच्च ऊर्जा की मांग करते हैं । इस के साथ संगत, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों और सामान्य रूप से उम्र बढ़ने के असंख्य के साथ जुड़ा हुआ है । केनोरहब्डिटिस एलिगेंस माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन के कई पेचीदगियों को elucidating के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का एक मजबूत संकेतक है और हाल ही में विकसित respirometers कोशिकाओं में श्वसन को मापने के लिए एक राज्य के अत्याधुनिक मंच प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम लाइव, अक्षुण्ण C. एलिगेंसका विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल ~ 7 दिनों की अवधि तक फैला है और (1) बढ़ रही है और सी elegans के तुल्यकालन के लिए कदम भी शामिल है, (2) यौगिकों की तैयारी इंजेक्शन और जांच का हाइड्रेशन, (3) दवा लदान और कारतूस equilibration, (4) कीड़ा परख की तैयारी थाली और परख चलाने के लिए, और (5) के बाद प्रयोग डेटा विश्लेषण ।
Introduction
एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), सेलुलर ऊर्जा का मुख्य स्रोत, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में एंजाइमों द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया में उत्पादित किया जाता है (आदि) भीतरी mitochondria झिल्ली में स्थित. पायरुवेट, माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन के लिए उपयोग किया जाने वाला एक महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट, माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में आयात किया जाता है, जहां एसिटिल कोएंजाइम ए (सीओए) का उत्पादन करने के लिए डिकार्बोक्सिलेटेड है । इसके बाद, एसिटाइल सीओए साइट्रिक एसिड चक्र में प्रवेश करता है जिसके परिणामस्वरूप निकोटिनमाइड एडेनिन डिन्यूक्लियोटाइड (नध) की उत्पत्ति होती है, जो एक मुख्य इलेक्ट्रॉन वाहक अणु है । नध से इलेक्ट्रॉनों के रूप में आदि के माध्यम से ऑक्सीजन को पारित किया जाता है, प्रोटॉन माइटोकॉन्ड्रियल इंटरमेम्ब्रेन अंतरिक्ष में निर्माण करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली के पार एक इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट उत्पन्न होता है । ये प्रोटॉन तो एटीपी synthase के प्रोटॉन छिद्र के माध्यम से mitochondrial मैट्रिक्स में वापस इस इलेक्ट्रोकेमिकल ढाल भर में interमेम्ब्रेन अंतरिक्ष से प्रवाह होगा, इसके रोटेशन और एटीपी1 के संश्लेषण ड्राइविंग (चित्रा 1).
माइटोकॉन्ड्रियल समारोह ऊर्जा उत्पादन तक ही सीमित नहीं है, लेकिन कैल्शियम होमियोस्टेसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) सफाई, और एपोप्टोसिस के लिए भी महत्वपूर्ण है, गंभीर रूप से अपने समारोह के आयोजन स्वास्थ्य2में स्थिति । माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का मूल्यांकन विभिन्न प्रकार के assays के उपयोग से किया जा सकता है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, एटीपी और ROS स्तर, और माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम सांद्रता को मापने वाले विश्लेषण तक सीमित नहीं हैं । हालांकि, ये assays माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का एक एकल स्नैपशॉट प्रदान करते हैं और इसलिए शायद माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का एक व्यापक दृश्य प्रदान नहीं करते हैं । एटीपी पीढ़ी के दौरान ऑक्सीजन की खपत के बाद से अनुक्रमिक प्रतिक्रियाओं के असंख्य पर निर्भर है, यह माइटोकॉन्ड्रियल समारोह के एक बेहतर संकेतक के रूप में कार्य करता है. दिलचस्प बात यह है कि ऑक्सीजन की खपत की दरों में बदलाव को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन3,4,5के परिणामस्वरूप देखा गया है ।
जीवित नमूनों की ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) तकनीक है कि मोटे तौर पर दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है का उपयोग कर मापा जा सकता है: amperometric ऑक्सीजन सेंसर और पॉर्फिरिन आधारित फोस्फोरस कि ऑक्सीजन से बुझती जा सकता है6. amperometric ऑक्सीजन सेंसर व्यापक रूप से संवर्धित कोशिकाओं, ऊतकों में ओसीआर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और जैसे मॉडल प्रणालियों में, सी एलिगेंसके रूप में. हालांकि, पोर्फिरिन आधारित respirometers युक्त फोस्फोरस निम्नलिखित लाभ के अधिकारी: (1) वे triplicate में दो नमूनों की ओर तुलना द्वारा एक पक्ष के लिए अनुमति देते हैं, (2) वे छोटे नमूना आकार की आवश्यकता होती है (जैसे, 20 कीड़े प्रति अच्छी तरह से बनाम ~ 2000 − 5000 कीड़े में चैंबर)7, और (3) आत्मशोधन प्रयोगात्मक चलाने भर में वांछित समय पर चार अलग यौगिक इंजेक्शन करने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है, मैनुअल आवेदन के लिए की जरूरत को नष्ट करने.
इस प्रोटोकॉल में, लाइव में ओसीआर को मापने के लिए पॉर्फिरिन आधारित ऑक्सीजन-सेंसिंग श्वसन मापी का उपयोग करने में शामिल कदम, अक्षुण्ण सी एलीगेंस का वर्णन किया गया है। जबकि वहाँ बड़े प्रारूप के उपयोग के लिए एक लिखित प्रोटोकॉल है, उच्च थ्रुपुट आत्मशोधन8, इस प्रोटोकॉल एक अधिक बजट के अनुकूल के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, सुलभ, और छोटे पैमाने पर साधन. यह प्रोटोकॉल दो उपभेदों के बीच ओसीआर में अंतर का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जहां उच्च थ्रोपुट स्क्रीनिंग की आवश्यकता नहीं है और इसका उपयोग अत्यधिक होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइटोकॉन्ड्रियल संवेदनाएं माइटोकॉन्ड्रियल फंक्शन का एक व्यावहारिक संकेतक है; इसलिए, एक जैविक प्रणाली में ऑक्सीजन की खपत की दर को मापने में सक्षम किया जा रहा है, चाहे इन विट्रो में या vivo में अत्यधिक मूल?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक प्रयोगशाला में seahorse xfp स्थापित करने में उनके मार्गदर्शन के लिए डॉ केविन bittman स्वीकार करना चाहते हैं । राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान के संस्थानों GM088213 इस काम का समर्थन किया.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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