Måling av oksygen inntak priser på intakt Caenorhabditis elegans
Summary
Mitokondrielt åndedrett er avgjørende for organismebiologi overlevelse; oksygen forbruksraten er derfor en god indikator på mitokondrie helse. I denne protokollen, vi beskrive bruken av et kommersielt tilgjengelig respirometer å måle basal og maksimalt oksygen forbruk priser i live, intakt, og fritt-motile Caenorhabditis elegans.
Abstract
Optimal mitokondrie funksjonen er avgjørende for sunn cellulære aktiviteten, spesielt i celler som har høy energi krav som de i nervesystemet og muskel. Samsvar med dette, mitokondrie dysfunksjon har vært forbundet med en myriade av nevrodegenerative sykdommer, og aging generelt. Caenorhabditis elegans har vært en kraftig modellsystem for Klargjørende mange vanskelighetene med mitokondrie funksjon. Mitokondrielt åndedrett er en god indikator på mitokondrie funksjon nylig utviklede respirometers tilbyr en state-of-the-art plattform for å måle åndedrett i celler. I denne protokollen gir vi en teknikk for å analysere live, intakt C. elegans. Denne protokollen gjelder ~ 7 dager og inneholder trinn for (1) økende og synkronisering av C. elegans, (2) av forbindelser skal injiseres og hydrering sonder, (3) stoff lasting og patron balanse, (4) utarbeidelse av ormen analysen plate og analysen kjøres, og (5) post eksperiment dataanalyse.
Introduction
Adenosin trifosfat (ATP), den viktigste kilden til celleenergien, produseres i mitokondrier av enzymer i elektronet transportkjeden (ETC) i indre mitokondrie membranen. Pyruvate, en nøkkel metabolitten benyttes for mitokondrie ATP produksjon, importeres inn i mitokondrie matrix hvor det er dekarboksyleres å produsere acetyl coenzyme A (CoA). Deretter inn acetyl CoA citric acid syklusen medføre generering av nikotinamid adenine dinucleotide (NADH), en nøkkel elektron carrier molekylet. Som elektroner fra NADH sendes til oksygen via osv, bygge protoner i mitokondrie intermembrane rom, som resulterer i genereringen av en elektrokjemisk forløpning over membranen. Disse protoner vil deretter flyte fra intermembrane plass over denne elektrokjemiske gradering tilbake i mitokondrie matrix gjennom proton pore av ATP syntase, roteringen og syntese av ATP1 (figur 1).
Mitokondrielt funksjon er ikke begrenset til energiproduksjon, men er også avgjørende for kalsium homeostase, reaktive oksygen arter (ROS) scavenging og apoptose, kritisk posisjonering deres funksjon i organismebiologi helse2. Mitokondrielt funksjonen kan vurderes ved hjelp av en rekke analyser, inkludert men ikke begrenset til analyser som måler mitokondrie membran potensial, ATP og ROS og mitokondrie kalsium konsentrasjoner. Men disse analyser gi ett bilde mitokondrie funksjon, og derfor kanskje ikke gir en omfattende oversikt over mitokondrie helse. Siden oksygenopptak ved ATP generasjon er avhengig av en rekke sekvensielle reaksjoner, fungerer det som en bedre indikator på mitokondrie funksjon. Interessant, er variasjoner i oksygen forbruk priser observert som følge av mitokondrie dysfunksjon3,4,5.
Oksygen forbruk priser (OCR) av levende prøver kan måles ved hjelp av teknikker som kan grovt inndeles i to grupper: amperometric oksygen sensorer og porphyrin-baserte fosfor som kan bli slukket av oksygen6. Amperometric oksygen sensorer har vært brukt mye å måle OCR i kulturperler celler, vev, og modellsystemer, slik som C. elegans. Men porphyrin-baserte fosfor som inneholder respirometers har følgende fordeler: (1) de tillater for en side ved side sammenligning av to prøvene i tre eksemplarer, (2) de krever mindre utvalgsstørrelsen (f.eks 20 ormer per brønn versus ~ 2, 000−5, 000 ormer i den kammer)7, og (3) i respirometer kan programmeres til å gjøre fire forskjellige sammensatte injeksjoner på ønsket ganger gjennom eksperimentell rensingen, eliminerer behovet for manuell program.
I denne protokollen er trinnene involvert i bruk en porphyrin-baserte oksygen-sensing respirometer å måle OCR i live, intakt C. elegans beskrevet. Mens det er en skriftlig protokoll for bruk av stort format, høy gjennomstrømning respirometer8, er denne protokollen tilpasset for bruk med en mer budsjett vennlig, tilgjengelig og mindre skala instrument. Denne protokollen er spesielt nyttig for å vurdere forskjellen i OCR mellom to stammer, hvor kreves ikke høy gjennomstrømming screening og bruk ville være overdreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrielt åndedrett er en innsiktsfull indikator på mitokondrie funksjon; Derfor er å kunne måle oksygen forbruk priser i et biologisk system, enten i vitro eller i vivo svært verdifull. Respirometers forstand oksygen nivåer ved hjelp av porphyrin-baserte fosfor som får slukket av oksygen eller via amperometric oksygen sensorer som stoler på generering av en elektrisk gjeldende forhold til oksygen press. Clark elektrode faller sistnevnte kategori og har vært brukt mye i litteratur, spesielt mens analysere å…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Kevin Bittman for hans veiledning i å etablere Seahorse XFp i laboratoriet. National Institutes of Health gir GM088213 støttet dette arbeidet.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochimie. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Génétique. 201, 1453-1466 (2015).
