Method Article

Imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive

DOI:

10.3791/59278

⸱

May 3rd, 2019

 , 
1Cancer Genomics Netherlands, Prinses Máxima Center for Pediatric Oncology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous décrivons une méthode pour l'imagerie multiphoton de time-lapse de haute résolution des cellules de tumeur de cerveau avant et après l'intervention chirurgicale invasive (par exemple, biopsie) dans le même animal vivant. Cette méthode permet d'étudier l'impact de ces procédures chirurgicales invasives sur le comportement migratoire, invasif et proliférant des cellules tumorales à un seul niveau cellulaire.

Abstract

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Les biopsies sont la norme de soin pour le traitement de cancer et sont médicalement salutaires car elles permettent le diagnostic plein de tumeur, le pronostic, et la détermination personnalisée de traitement. Cependant, la perturbation de l'architecture de tumeur par biopsie et d'autres procédures envahissantes a été associée aux effets indésirables sur la progression de tumeur, qui doivent être étudiés en profondeur pour améliorer davantage l'avantage clinique de ces procédures. Les approches statiques conventionnelles, qui fournissent seulement un instantané de la tumeur, sont limitées dans leur capacité de révéler l'impact de la biopsie sur le comportement de cellules de tumeur telle que la migration, un processus étroitement lié à la malignité de tumeur. En particulier, la migration de cellules de tumeur est la clef dans les tumeurs fortement agressives de cerveau, où la diffusion locale de tumeur rend la résection totale de tumeur pratiquement impossible. Le développement de l'imagerie multiphoton et des fenêtres d'imagerie chronique permet aux scientifiques d'étudier ce processus dynamique chez les animaux vivants au fil du temps. Ici, nous décrivons une méthode pour la formation image longitudinale à haute résolution des cellules de tumeur de cerveau avant et après une biopsie dans le même animal vivant. Cette approche permet d'étudier l'impact de cette procédure sur le comportement des cellules tumorales (migration, invasion et prolifération). En outre, nous discutons les avantages et les limites de cette technique, aussi bien que la capacité de cette méthodologie d'étudier des changements dans le comportement de cellules cancéreuses pour d'autres interventions chirurgicales, y compris la résection de tumeur ou l'implantation de la chimiothérapie Gaufrettes.

Introduction

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La norme de soin pour la plupart des tumeurs pleines inclut la biopsie de tissu pour le diagnostic, le pronostic, et la détermination personnalisée de traitement1,2. Dans l'ensemble, ces procédures donnent l'avantage clinique, mais les preuves récentes indiquent que la biopsie et d'autres procédures plus invasives, telles que la résection de tumeur, peuvent également influencer négativement la progression de tumeur3,4,5 , 6. Bien que ces procédures demeurent indispensables aux soins hospitaliers et que leurs bienfaits surmontent leurs effets négatifs, il est nécessaire de bien comprendre les mécanismes qui sous-tendent ces effets négatifs afin de maximiser la sécurité des patients et influences positives de ces procédures et les rendent encore plus bénéfiques sur le plan clinique.

Les effets indésirables de biopsie-négociés sur la progression de tumeur sont déclenchés par des altérations systémiques et des changements dans le microenvironnement de tumeur en réponse à la perturbation de tissu4,5. Ainsi, il est nécessaire d'étudier ce processus chez les animaux vivants. Cependant, les conséquences subtiles de ces procédures mini-invasives peuvent souvent être déguisées par de grandes variations entre les individus. Les méthodes conventionnelles basées sur l'immunohistochimie ou l'analyse transcriptionnelle d'expression peuvent négliger ces effets ou exiger un grand nombre d'animaux pour les identifier. En outre, ces approches statiques n'ont pas la capacité d'identifier des changements dans le comportement de cellules de tumeur tels que la migration et l'invasion, processus dynamiques qui corrélensont avec la malignité de tumeur. Ces dispositifs de cellules de tumeur sont d'importance particulière pour les tumeurs cérébrales fortement agressives, telles que le multiforme de glioblastoma (GBM), où la diffusion locale des cellules de tumeur limite la résection chirurgicale et diminue la surviepatient7. Pour bien comprendre comment les biopsies affectent le comportement des cellules GBM, une approche longitudinale qui permet la visualisation de ces cellules dans le contexte physiologique des organismes vivants est nécessaire.

Le développement récent de l'imagerie intravitale à haute résolution en combinaison avec des fenêtres d'imagerie chronique implantées chirurgicalement permet aux scientifiques d'étudier le comportement dynamique des cellules tumorales chez les souris vivantes sur plusieurs jours8,9. En utilisant cette approche puissante, nous pouvons étudier comment les cellules tumorales proliférant, migratoire, et le comportement infiltratif change sur plusieurs jours en réponse à une biopsie dans la même souris. Comparé à d'autres techniques qui permettent la surveillance de plusieurs jours des tumeurs chez les souris vivantes, telles que l'imagerie par résonance magnétique (MRI)10, la tomographie par émission de positrons/tomographie calculée (PET/CT)11, ou l'imagerie bioluminescente12, cette l'approche offre unique la possibilité d'étudier le comportement de cellule de tumeur au niveau de cellules simples et de démêler les changements subtils se produisant dans la tumeur.

Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour exécuter la biopsie-comme des dommages et l'imagerie intravital longitudinale pré- et postbiopsie dans le cerveau des souris tumeur-portantes. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour étudier d'autres interventions chirurgicales, telles que la résection partielle de tumeur ou l'implantation des gaufrettes de chimiothérapie.

Protocol

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Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives du Comité du bien-être animal de l'Académie royale des arts et des sciences des Pays-Bas, aux Pays-Bas. Les protocoles expérimentaux utilisés dans ce manuscrit ont été approuvés par la Commissaire centrale Dierproeven (CCD) et l'Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).

1. Implantation de cellules tumorales et préparation de fenêtre d'imagerie crânienne

  1. Préparation chirurgicale
    1. Utilisez des souris adultes (à l'âge de 6 semaines) de n'importe quelle souche ou sexe. Sédatif d'une souris en injectant (fluanisone [neuroleptique] - fentanyl [opioïde]) (0,4 mL/kg) - sédatif benzodiazépine (2 mg/kg) à une dose de 1:1:2 dans l'eau stérile. Évaluer l'état de sédation de l'animal par pincement d'orteil.
      REMARQUE : Dans ce protocole, les souris femelles et mâles de C57BL/6 ont été employées dues au même fond génétique de la ligne de cellules de tumeur employées dans ces expériences (GL261). La souris restera entièrement sous sédatif pendant 1,5 h. Alternativement, utiliser l'anesthésie par inhalation comme l'isoflurane (1,5% à 2% isoflurane/O2 mélange).
    2. Montez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixez la tête à l'aide d'une pince nasale et de deux barres d'oreilles.
    3. Utilisez une lampe chauffante pour préserver la température corporelle. La lampe de chauffage doit être employée avec prudence, alternativement des coussins de chauffage de recirculation d'eau peuvent être employés.
    4. Appliquer de la pommade pour les yeux pour protéger les cornées de la souris contre le séchage.
    5. Utilisez des ciseaux pointus pour raser la fourrure sur le crâne (zone dorsale des yeux de la souris à la base de son crâne) et désinfecter la peau exposée avec 70% d'éthanol.
    6. Couper la peau d'une manière circulaire avec des ciseaux pointus et gratter le périoste en dessous avec un coton-tige. Appliquer une goutte de lidocaïne 1% et de l'épinéphrine 1:100.000 pendant 5 min, et retirer l'excédent avec un coton-tige.
    7. Coller les bords de la peau au crâne avec de la colle cyanoacrylate.
    8. Placez le cadre stéréotaxique sous un microscope stéréo dissection avec grossissement 4x.
    9. Visualisez le crâne à travers le microscope de dissection et percez une rainure circulaire de 5 mm de diamètre au-dessus de l'os pariétal droit. Effectuez cette étape avec soin et seulement superficiellement, en évitant toute pression sur le crâne.
    10. Appliquer une goutte de cortex tampon (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucose, 10 mM de tampon HEPES, 2 mM MgSO4et 2 mM CaCl2 [pH 7,4]) et soulever le rabat osseux à l'aide de fines forceps.
    11. Pour les étapes suivantes, gardez la surface du cerveau recouverte d'un tampon de cortex, sauf indication contraire.
    12. Sous le microscope de dissection, visualisez la surface du cerveau et retirez le dura mater à l'aide de pinces à épiler à pointe sinbé, effilée et très fine. Si le saignement se produit à ce stade, utilisez une éponge de gélatine absorbable pour l'arrêter.
  2. Injection de cellules tumorales
    1. Resuspendre la quantité désirée de cellules tumorales fluorescentes dans 3 l l de PBS (par exemple, pour les expériences montrées dans ce protocole, 1 x 105 cellules GL261 ont été injectées).
      REMARQUE: Bien que n'importe quel marqueur fluorescent peut être utilisé, un marqueur nucléaire est fortement conseillé, pour suivre les cellules tumorales individuelles au cours de l'analyse. En outre, un marqueur fluorescent lié à l'histone, comme h2B, peut être utilisé pour visualiser la condensation chromosomique et, par conséquent, pour surveiller la division cellulaire. L'utilisation d'un marqueur photo-switchable, tel que Dendra2, permet le marquage photo et le suivi des cellules tumorales sur plusieurs jours4,13.
    2. Chargez les cellules tumorales dans une seringue étanche au gaz de 10 l avec une aiguille de style point 2 et fixez-la sur le bras de manipulateur stéréotaxique.
    3. Retirez le tampon du cortex. Placez la pointe de la seringue au milieu de la craniotomie et insérez-la à une profondeur de 0,5 mm de la surface du crâne. Optionnellement, créer un petit espace dans le cerveau pour accueillir la suspension des cellules tumorales. Pour cela, insérez la seringue jusqu'à une profondeur de 1 mm, puis récupérez-la jusqu'à 0,5 mm avant l'injection.
    4. Appliquer une goutte de tampon cortex.
    5. Injectez lentement la suspension cellulaire à l'aide d'un injecteur de microseringue (250 à 400 nL/min). Retirez la seringue et utilisez une éponge à gélatine absorbable pour arrêter tout saignement, si nécessaire.
  3. Préparation de fenêtre d'imagerie crânienne
    1. Retirez le tampon du cortex et placez une goutte d'huile de silicone sur le site de la craniotomie pour éviter les bulles d'air sous la fenêtre.
    2. Scellez le cerveau exposé avec un bordereau de 6 mm. Appliquer de la colle cyanoacrylate entre la couverture et le crâne. Appuyez doucement sur la feuille de couverture contre le crâne à l'aide de fines pinces à épiler pour assurer une distance minimale entre le cerveau et la couverture.
    3. Appliquer du ciment acrylique dentaire sur la surface du crâne, en couvrant le bord de la glissière. Placez un mince anneau en acier inoxydable (1,5 mm de diamètre extérieur, 1 mm de diamètre intérieur) autour de la craniotomie et laissez sécher le ciment dentaire. Optionnellement, ajouter un peu de colle sur la bordure pour fixer l'anneau sur le dessus de la tête.
      REMARQUE : Ce système de fixation de tête est optimal pour l'imagerie sur un microscope inversé : de petits aimants incorporés dans la boîte d'imagerie facilitent la fixation de la fenêtre d'imagerie crânienne (CIW). Dans les expériences montrées dans ce protocole, un microscope inversé a été employé. Pour les microscopes droits, la fixation peut être réalisée au moyen d'une barre ou d'un anneau avec des rainures qui peuvent être fixées au microscope à l'aide de vis ou d'une plaque qui s'adapte à l'anneau.
    4. Pour la gestion de la douleur, injecter une dose unique de 100 g/kg de buprénorphine sous-cutané et permettre à l'animal de récupérer sur un coussin chauffant.
    5. Placez la souris dans une cage individuelle avec du papier déchiqueté pour l'enrichissement. Surveillez de près la souris tous les jours pendant les premiers jours et 2 fois par semaine, par la suite, pour le comportement normal, la réactivité et l'apparence.

2. Imagerie intravitale

REMARQUE : L'intervalle de temps entre l'injection de cellules de tumeur et la première session de formation image intravital dépend du type de ligne de cellules de tumeur employée. Pour les expériences montrées dans ce protocole, 1x 105 cellules GL261 ont été injectées et imaged 10 jours plus tard.

  1. Préparation à l'imagerie
    1. Sédatez la souris à l'aide d'une anesthésie par inhalation d'isoflurane à l'aide d'un masque facial (mélange de 1,5 % à 2 % d'isoflurane/O 2).
    2. Injecter la souris sous-cutanée avec 100 l de tampon salin pour prévenir la déshydratation.
      REMARQUE : Pour l'imagerie à long terme, la souris peut être hydratée par une pompe à infusion sous-cutanée.
    3. Placez la souris face cachée dans une boîte d'imagerie. Utilisez une plaque métallique avec un trou de 1 mm de diamètre et de petits aimants intégrés autour de l'ouverture pour fournir la fixation du CIW à la boîte d'imagerie. Introduire l'isoflurane à travers un masque facial et ventiler par une prise de l'autre côté de la boîte (0,8% à 1,5% isoflurane/O2 mélange). Optionnellement, utilisez du ruban adhésif pour fixer le corps de la souris.
      REMARQUE : Le dextran étiqueté fluorescent pour la visualisation des vaisseaux sanguins ou d'autres colorants peut être injecté par voie intraveineuse à ce stade.
    4. En option, utilisez un oxymètre d'impulsion et une sonde chauffante pour surveiller les signes vitaux de la souris.
      REMARQUE : Dans cette expérience, il n'était pas nécessaire d'utiliser un oxymètre d'impulsion et une sonde chauffante puisque la souris était stable tout au long de la période d'imagerie (2 à 3 h). Cependant, pour des temps d'imagerie plus longs, une surveillance plus approfondie peut être nécessaire.
    5. Placez l'objectif d'eau 25x (p. ex. HCX IRAPO NA0.95 WD 2,5 mm) à la position zla plus basse et ajoutez une grande goutte d'eau.
      REMARQUE : L'utilisation d'un micro distributeur d'immersion en eau est fortement conseillée pour les expériences à long terme puisqu'elle permet aux scientifiques d'ajouter de l'eau pendant l'expérience. Alternativement, un objectif sec peut être utilisé.
    6. Transférer la boîte d'imagerie sur le microscope équipé d'une chambre climat sombre maintenue à 37 oC. Apportez l'objectif à la glissière ciW jusqu'à ce que la goutte d'eau le touche.
    7. En utilisant le mode épifluorescence, observez la tumeur à travers l'oculaire et mettre les cellules au point.
  2. Acquisition d'images time-lapse
    1. Sélectionnez plusieurs positions d'intérêt pour l'image, et enregistrez leurs coordonnées dans le logiciel. Assurez-vous que les positions sélectionnées sont des positions représentatives de différents sites de la tumeur (chaque tumeur peut être différente, mais pour assurer la cohérence, sélectionnez la même quantité de positions qui sont centrales au noyau de tumeur et aux bords à travers toutes les souris).
      REMARQUE : Un balayage de tuile d'une partie de la tumeur ou de la tumeur visible entière peut être exécuté ; cependant, si la tumeur est grande, cette méthode augmentera le time-lapse entre les images. En outre, si les cellules tumorales se déplacent rapidement, il peut être difficile de suivre les mêmes cellules au fil du temps.
    2. Passez en mode multiphoton et accordez le laser à la longueur d'onde correcte. Notez que, pour éviter les photodamages, des longueurs d'onde plus élevées sont souhaitées.
      REMARQUE : Pour l'imagerie Dendra2, une longueur d'onde de 960 nm a été utilisée. Avec l'objectif utilisé dans ces expériences, un zoom de 1.3 était suffisant pour obtenir une bonne résolution des noyaux de tumeur et de scanner une zone représentative de la tumeur.
    3. Passez au mode live et définissez une z-pile pour chaque position afin d'acquérir le volume maximal de cellules tumorales sans compromettre la résolution des cellules tumorales. Définissez la taille de l'étape entre les images comme étant de 3 m.
    4. Utilisez le mode bidirectionnel pour augmenter la vitesse de numérisation. La résolution de l'image doit être d'au moins 512 x 512 pixels.
    5. Acquérir des images du volume tumoral à différentes positions toutes les 20 min pendant 2 h. Ajouter de l'eau à l'objectif avant chaque acquisition d'image.
      REMARQUE : Les images en accéléré peuvent être automatiquement acquises en définissant le bon time-lapse dans le logiciel. Cependant, la souris peut se déplacer, et la position ou z-stack peut se déplacer au fil du temps, causant la perte de données. Par conséquent, il est recommandé d'effectuer le time-lapse manuellement et de vérifier et ajuster pour les changements xyz entre les acquisitions.
    6. À cette étape, en option, photo-switch le marqueur fluorescent Dendra2.
      REMARQUE: Contrairement à l'imagerie time-lapse (qui permet d'étudier les propriétés des cellules tumorales individuelles et comment ils changent au fil du temps), cela permettra d'étudier la zone de l'infiltration des cellules tumorales dans le cerveau sur plusieurs jours4. Une explication détaillée de cette étape est décrite par Gligorijevic et coll.13.
    7. Une fois la dernière image acquise, retirez la souris de la scène et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant. Pour prévenir la déshydratation, 100 l de saline peuvent être administrés sous-cutané. Placez la souris dans sa cage jusqu'à ce que la blessure ressemblant à une biopsie soit effectuée.

3. Blessures de type biopsie et remplacement de CIW

  1. Créez une lésion ressemblant à une biopsie au site tumoral 1 jour après la première séance d'imagerie.
    REMARQUE : Alternativement, une autre procédure, comme l'enlèvement partiel de tumeur, peut être exécutée.
    1. Sédatez la souris à l'aide de l'anesthésie par inhalation d'isoflurane telle que décrite précédemment à l'étape 2.1.1.
      REMARQUE : Bien que l'anesthésie injectable puisse être utilisée, cette procédure est plus courte que l'implantation de CIW, et l'anesthésie par inhalation permet de contrôler avec précision et de réduire le temps que la souris reste sous sédatif.
    2. Placez la souris sur un cadre stéréotaxique et fixez sa tête avec deux barres d'oreilles et une pince à nez. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réflexes de pédale. Utilisez un masque d'anesthésie pour la chirurgie stéréotaxique pour garder la souris sous sédatif pendant la procédure.
    3. Tremper un coton-tige dans de l'acétone et l'étaler sur le bord de la couverture pour adoucir la colle qui tient la couverture contre le cerveau.
    4. Glissez les forceps à points minces sous la glissière de couverture pour le soulever. Si le bordereau se brise à ce point, utilisez les forceps pour enlever les morceaux de verre.
    5. Appliquer un tampon cortex pour garder le cerveau humide.
    6. Trempez une aiguille de 25 G dans la tumeur à une profondeur de 1 mm. Retirez l'aiguille et arrêtez le saignement, si nécessaire, en appliquant une éponge stérile à la gélatine.
      REMARQUE: Cette étape peut être effectuée sous un stéréomicroscope fluorescent pour identifier plus précisément la zone tumorale (si la tumeur est trop petite). De plus, une solution de 1 l de perles fluorescentes en polystyrène de 1 m peut être injectée pendant la ponction afin d'identifier la zone biopsiée.
    7. Scellez la surface du cerveau avec de l'huile de silicone et collez un bordereau de 6 mm sur le dessus.

4. Imagerie répétée

  1. Un jour après avoir infligé la biopsie-comme la blessure (et les jours consécutifs si nécessaire), répéter la formation image intravitale comme décrit dans l'étape 2 ci-dessus pour évaluer comment le comportement de cellules de tumeur change au fil du temps. Sélectionnez plusieurs positions de la tumeur qui seraient représentatives de la zone entière de tumeur.
    REMARQUE : Si des perles fluorescentes ont été employées pour identifier la zone biopsied, les localiser pour imager le comportement de cellules de tumeur dans les régions psipées comparées aux régions non-biopsied.

5. Analyse d'image

  1. Si les images en time-lapse ont été acquises manuellement, combinez-les en un seul dossier.
    1. Ouvrez le fichier LIF en time-lapse dans le logiciel commercial associé au microscope (p. ex., LasX ou LAS AF). Sélectionnez le processus d'onglet 'gt; Outils de processus 'gt; Fusionner. Sélectionnez la première image de la séquence temporelle et cliquez sur First. Sélectionnez la deuxième image de la séquence temporelle et cliquez sur Second. Dans Merge Dimensions, sélectionnez t pour le temps. Cliquez sur Appliquer. Un nouveau fichier avec deux points de temps sera généré. Répétez ce processus pour tous les points de temps, en utilisant le fichier nouvellement généré comme la première image de la séquence.
  2. Corriger les z-stacks acquis pour n'importe quel décalage xyz.
    REMARQUE : Pour les expériences décrites dans ce protocole, un logiciel Visual Basic conçu sur mesure a été utilisé pour la correction. Alternativement, d'autres logiciels disponibles peuvent être utilisés, tels que ImageJ ou Imaris.
    1. Exportez les fichiers TIFF à partir du logiciel en cliquant à droite sur le fichier en accéléré fusionné. Sélectionnez Enregistrer des données RAW. Les fichiers exportés seront exportés vers un dossier nommé en fonction du canal, du temps et de la position z.
    2. Ouvrez les fichiers TIFF dans le logiciel Visual Basic conçu sur mesure.
    3. Définissez le nombre de points de temps, de z-stacks et de canaux.
    4. Attribuez une couleur à chaque canal par l'ordre d'apparence.
    5. Dans le panneau Form Show, pour chaque point de temps, corrigez le décalage dans le z en cliquant sur les boutons up (U) ou Down (D).
    6. Dans le panneau de construction d'images Intravital, sélectionnez le canal à utiliser pour corriger le décalage xy. Sélectionnez le canal vert à corriger, en fonction du signal des cellules tumorales. Cliquez sur Automatique pour la correction xy.
    7. Exporter les images corrigées comme une projection maximale de trois z-stacks consécutifs. Dans le panneau Sélection, introduire les numéros de la première (Begin) et la dernière (Fin) z-tranches à exporter. Sélectionnez Max. Sélectionnez dossiers séparés pour Z. Cliquez sur Ne. Pour chacun d'eux, trois z-stacks, images en time-lapse seront exportés vers un dossier séparé.
  3. Optionnellement, correct pour la déformation élastique de tissu.
    REMARQUE : Pour les expériences de déformation élastique des tissus, un logiciel de compensation de mouvement d'allumette a été employé pour corriger la déformation rigide et élastique de tissu14.
  4. Suivez les cellules individuelles dans le z-stack complet dans le film time-lapse.
    REMARQUE : Les cellules tumorales peuvent être suivies manuellement à l'aide, par exemple, d'un plugin ImageJ (MTrackJ). Bien que précis, cela se limite au plan xy et prend beaucoup de temps. Alternativement, les cellules tumorales peuvent être suivies automatiquement tout au long du z-volume complet, en utilisant la segmentation des cellules tumorales (par exemple, le logiciel Imaris). Cependant, dans les tumeurs très denses, le suivi automatisé est moins précis et peut donner lieu à plus d'erreurs de suivi.
    1. Ouvrez et suivez chaque série time-lapse (pour trois z-stacks consécutifs) séparément. Faites glisser le dossier contenant les images time-lapse sur ImageJ.
    2. Sélectionnez l'onglet Plugins 'gt; Suivi 'gt; MtrackJ. Suivez chaque cellule en sélectionnant Ajouter et en cliquant sur chaque cellule à chaque point de temps.
    3. Extraire la mesure des pistes en cliquant sur Mesurer et enregistrer le fichier.

Results

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Pour évaluer l'impact de la biopsie sur le comportement de cellules de tumeur de cerveau, nous avons exécuté la procédure décrite dans ce protocole. Glioma—GL261 cells—expressing a nuclear fluorescent protein (H2B-Dendra2) were injected in the brain of C57BL/6 mice, and a chronic CIW was implanted. L'imagerie intravitale time-lapse a été réalisée sur le même animal pré- et post-biopsie-comme la blessure à la tumeur (Figure 1A, B). La migration des cellules tumorales individuelles a été déterminée en suivant le chemin de migration au fil du temps dans différents plans xy de la z-pile (Figure 1C) et tracée en pourcentage des cellules migratrices avant et postbiopsie (Figure 1F). Le taux de prolifération des cellules tumorales a été quantifié en fonction de la condensation Dendra2 marquée par H2B sur la mitose (Figure 1D) et tracée en pourcentage des cellules de division avant et postbiopsie (Figure 1E). Nous avons comparé la répartition de la vitesse de migration avant et après la biopsie dans la même tumeur et nous avons constaté que le nombre de cellules migratrices (vitesse de 4 m/h) a augmenté après l'intervention, avec une diminution associée du nombre de cellules lentes/non-migratoires ( vitesse de lt; 4 m/h) (Figure 2A). En moyenne par tumeur, nous avons observé une augmentation de 1,75 (SD - 0,16) du pourcentage de cellules migratrices lorsqu'une lésion ressemblant à une biopsie a été pratiquée, comparativement à des souris témoins qui n'ont pas été biopsiées (figure 2B). Nous avons surveillé le comportement des cellules tumorales pendant une autre semaine et nous avons constaté que, bien que le pourcentage de cellules tumorales migratrices ait finalement diminué chez les souris témoins et biopsiées, les souris biopsiées présentaient encore une capacité migratoire plus élevée que les souris témoins ( Figure 2C). L'analyse du comportement proliférant des cellules tumorales au fil du temps a montré une augmentation de 1,52 (SD - 0,26) du nombre d'événements mitotiques lors de la biopsie, par rapport aux souris témoins non biopbiologiques (Figure 2D).

Pour tester si les effets observés de la biopsie sur la prolifération des cellules tumorales et le comportement migratoire était un artefact dû à la chirurgie de remplacement CIW (nécessaire pour effectuer une biopsie-comme la blessure), nous avons surveillé le comportement de cellules de tumeur dans un groupe de souris qui ont subi CIW remplacement sans biopsie. Dans ce groupe, nous n'avons observé aucune induction de migration ou prolifération des cellules tumorales, ce qui indique que l'augmentation de la prolifération des cellules tumorales et des taux de migration a été spécifiquement déclenchée par des lésions semblables à celles d'une biopsie (figure3A, B).

La photo-convertibilité stable de la protéine fluorescente Dendra2 permet d'étudier l'infiltration des cellules tumorales sur plusieurs jours. Lors de l'exposition à la lumière ultraviolette/bleue, Dendra2 passe du vert au rouge. À l'aide de cette propriété, une région carrée de la tumeur a été illuminée et 200 cellules tumorales exprimant Dendra2 ont été marquées par photo avant la biopsie (Figure 4). Un jour après la biopsie, nous avons relocalisé la région photo-commutée et mesuré le volume des cellules de tumeur qui s'étaient infiltrées dans le tissu de tumeur environnant. Nous avons constaté que la zone d'infiltration était 1,72 (SD - 0,41) fois plus grande dans les tumeurs après une biopsie-comme des dommages comparés aux tumeurs témoins non biopbiologiques (figure 4). Bien que cette approche ne fournit que des informations sur le comportement infiltrat en vrac des cellules tumorales et non sur un seul niveau cellulaire, elle prend moins de temps que l'approche d'imagerie en accéléré et peut être la méthode de choix pour les questions de recherche axées exclusivement sur l'étude du comportement infiltratif.

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Figure 1 : Configuration expérimentale pour l'imagerie intravitale longitudinale de l'effet de biopsie sur le comportement des cellules tumorales. (A) Diagramme montrant la conception de l'anneau et du support magnétique. (B) Représentation schématique du flux de travail expérimental. Des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau des souris et un CIW est établi. Au développement de tumeur, une première session de formation image de time-lapse (prébiopsie) est exécutée. Le lendemain, la biopsie et le remplacement de CIW sont mis en œuvre. Le lendemain de l'imagerie (postbiopsie), une deuxième séance d'imagerie en accéléré est effectuée. Pour les effets à long terme, des séances d'imagerie ultérieures peuvent être effectuées. (C) Les images montrent des instantanés représentatifs d'un film en time-lapse où les cellules tumorales GL261 H2B-Dendra2 ont été suivies. Les lignes rouges dépeignent des traces individuelles de cellules tumorales. La barre d'échelle de 50 m . (D) Représentant in vivo des images en time-lapse affichant des cellules de division dans les tumeurs GL261 H2B-Dendra2. Différentes étapes de la mitose sont indiquées : prophase (P), proméaphase (Pm), métaphase (M), anaphase (A) et télophase (T). La barre d'échelle de 50 m.Les graphiques indiquent le pourcentage de cellules migratrices (E) et (F) qui divisent les cellules avant et après la postbiopsie. Chaque point indique le pourcentage de cellules migratrices dans toutes les positions mesurées chez un animal individuel. Les données sont présentées comme moyennes - S.E.M. de six souris (P 'lt; 0.01, t-testjumelé). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : Résultats représentatifs montrant l'impact de la biopsie sur les taux de migration et de prolifération des cellules tumorales. (A) Parcelles de chute d'eau montrant le changement dans la distribution de la vitesse cellulaire par rapport à la migration basale chez les souris individuelles. Les données sont présentées comme moyennes - S.E.M. de cinq souris. (B) Le nombre de cellules migratrices contrôlées (bleues) et biopsiées (rouges) animaux normalisés au nombre de cellules migratrices pré-intervention (n - 6 souris,P lt; 0,0001, Student's t-test). (C) Le comportement des cellules tumorales a été suivi sur plusieurs jours. On montre le nombre normalisé (par rapport à la pré-intervention) de cellules migratrices chez les souris individuelles au fil du temps(n 'gt; 4 souris par condition, 'P 'lt; 0.0001, bidirectionnelle ANOVA). (D) Le nombre normalisé de cellules de division sous contrôle (bleu) et d'animaux biopsiés (rouges). Par animal, les valeurs post-intervention ont été normalisées aux valeurs pré-intervention (n ' 5 souris, 'P 'lt; 0.01, Student's t-test). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Le remplacement de CIW n'a aucun effet sur le comportement des cellules tumorales. L'imagerie intravitale longitudinale montre que le remplacement du CIW sans biopsie n'a aucun effet sur les taux de migration et de prolifération. (A) L'augmentation du nombre de cellules migratrices pour les conditions indiquées. Chaque symbole représente la moyenne d'une souris individuelle, et n4 souris. (B) L'augmentation du nombre de cellules proliférantes pour les conditions indiquées. Chaque symbole représente la moyenne d'une souris individuelle (n 4 souris, P 'lt; 0.01,'P 'lt; 0.001, ns 'non significatif, anocel way avec Newman-Keuls post hoc test). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure-results-4
Figure 4 : Diagramme montrant la configuration expérimentale et les résultats représentatifs obtenus avec dendra2 photo-switching. Pour surveiller l'infiltration de cellules de tumeur sur la biopsie, les cellules de tumeur Dendra2-exprimant sont photo-commutées dans une région carrée par l'illumination UV/lumière bleue et imaged, 1 jour avant la biopsie. Un jour après la biopsie, la région photo-commutée est relocalisée et réimage. Sont montrées les images représentatives de Dendra2 de l'infiltration de cellules de tumeur, corrigées utilisant la soustraction de canal. La ligne pointillée blanche représente la zone d'infiltration. La barre d'échelle de 50 m. Le graphique montre l'augmentation de la zone photo-commutée tracée pour les souris biopsiées (rouges) et de contrôle (bleues). Chaque point représente la valeur moyenned'une souris individuelle (n 5 souris,P lt; 0,05, Student's t-test). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

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Ici nous décrivons une méthode pour étudier des changements dans le comportement de cellules de tumeur au niveau de cellules simples en réponse aux procédures chirurgicales envahissantes, telles qu'une biopsie, dans le cerveau d'un animal vivant. La combinaison de la formation image multiphoton longitudinale avec l'implantation chirurgicale d'un CIW chronique permet la quantification de la migration, de l'invasion et de la prolifération des cellules tumorales avant et après la biopsie chez le même animal4. Comparée à d'autres approches utilisées pour la surveillance multiquotidienne de tumeur, telle que l'imagerie bioluminescente12,MRI10, ou PET/CT11,cette méthode visualise de façon unique des tumeurs sur un niveau unicellulaire et, ainsi, fournit la perspicacité dans le comportement cellulaire progression tumorale sous-jacente.

Pour effectuer avec succès cette méthode, plusieurs procédures doivent être maîtrisées. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'implantation et le remplacement de CIW. La complexité technique de ces étapes exige des compétences techniques et de précision qui peuvent être acquises avec une formation régulière. Les complications pendant la chirurgie de CIW, telles que le saignement qui peut couvrir la surface de cerveau, peuvent s'avérer provocants pour la formation image suivante. Le manque d'outils ou d'environnement stériles, ainsi que l'incapacité de sceller complètement la surface du cerveau, peuvent causer une infection à la surface du cerveau (liquide blanc sous la couverture), ce qui rendra l'imagerie problématique et compromettra fortement les interprétation. Un autre problème commun de ce protocole est le mouvement animal pendant l'imagerie de time-lapse. Bien que tout changement de xyz puisse être corrigé après l'expérience, il est recommandé de corriger le point de coordonnées de chaque position avant chaque point de temps afin d'éviter toute perte d'information. La déformation des tissus est un problème supplémentaire constaté lors de l'imagerie sur un microscope inversé. Le tissu cérébral souffre de compression lorsque la souris est placée en position de supine. Selon le degré de déformation des tissus, le suivi des cellules tumorales peut conduire à une quantification erronée du déplacement cellulaire. Pour éviter cela, un logiciel pour la déformation rigide et élastique peut être utilisé14.

Tandis que cette procédure offre une application large pour étudier des changements dans le comportement de tumeur, certaines limitations devraient être considérées. Cette méthode permet aux scientifiques d'imager jusqu'à une profondeur de 1,6 mm (avec l'utilisation d'un oscillateur paramétrique optique); cependant, cela signifie que l'imagerie est limitée aux zones superficielles du cortex cérébral15. Ainsi, quelques tumeurs de cerveau situées dans les structures profondes de cerveau, y compris les gliomes intrinsèques diffus de pontine situés dans la région de tronc cérébral, ne peuvent pas être étudiées dans leur environnement original de cerveau avec ce protocole. Une autre limitation de ce protocole est le volume de la tumeur qui peut être photographié. Bien que le balayage total de volume de tumeur soit désiré pour obtenir l'information maximale, souvent, la taille de tumeur et la vitesse des cellules migratrices peuvent être des facteurs limitants. Pour chaque type de tumeur, un time-lapse optimal pour la formation image doit être considéré. Si le délai entre les images est trop long, il peut être difficile de suivre les cellules tumorales. L'utilisation d'un scanner résonant peut fortement diminuer le temps de balayage, permettant l'imagerie d'une plus grande tumeur16. Enfin, l'analyse manuelle de l'image de ce protocole peut prendre beaucoup de temps, de sorte que les programmes de suivi 3D automatisé peuvent être utilisés. Cependant, les résultats du suivi doivent toujours être supervisés visuellement puisque les algorithmes de suivi automatisé des cellules sont rarement conçus pour récapituler exactement la migration des cellules d'intérêt.

De légères adaptations du protocole décrites ici peuvent permettre un éventail encore plus large d'applications. Au lieu d'effectuer des biopsies, d'autres interventions (chirurgicales) peuvent être mises en œuvre, telles que la résection partielle de tumeur ou la livraison des gaufrettes de chimiothérapie. L'ajout de composés par un microtube implanté chirurgicalement peut être combiné avec ce protocole pour cibler pharmacologiquement des molécules spécifiques d'intérêt. Nous nous attendons à ce que ce modèle soit utile dans les études visant à analyser l'impact d'une certaine intervention sur le comportement des cellules tumorales. La possibilité d'effectuer des mesures répétées chez le même animal fournit non seulement des données plus précises sur les changements se produisant dans la tumeur, mais réduit également considérablement le nombre d'animaux expérimentaux nécessaires par étude.

Disclosures

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Anko de Graaff et le Hubrecht Imaging Center pour leur soutien en imagerie et Ellen Wehrens et Hannah Johnson pour la relecture et l'édition du manuscrit.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25g x 16 mm aiguilles hypodermiquesBD Microlance300600
701 RN 10uL SYR W/O NEEDLEHamilton7635-01
Éponge résorbable en gélatinePfizerGelfoam
Coverslips ronds 6 mmVWR international631-0168
Colle cyanoacrylatePattexPattex Ultra gel
Dental cimentVertex DentalVertex Self-Curing
DrillDremelDremel 3000 (la perceuse dentaire peut être plus pratique) + 105 Coupe-gravure
Pince à épiler fine incurvéeDumontAGT508
HypnormVetaPharma LtdHypnorm (Citrate de fentanyl 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml)
MidazolamActavisMidazolam Actavis 5mg/ml
Pommade ophtalmiqueKela VeterinariaDuodrops veter kela 10 m
Injecteur stéréotaxique Quintessential (QSI)Stoelting53311
Huile de siliconeSigma Aldrich181838
Cadre stéréotaxiqueStoeltingLab stéréotaxique, rat et souris
Stéréomicroscope chirurgicalOlympus
Temgesic (0,3 mg/ml)BD Pharmaceuticals283732
Vannas Tü ; Bingen Ciseaux à ressortHarvard Appareil72-8508
Xylocaïne (Lidocaïne 1 % + Épinéphrine 1:100 000) Anesthésique localAstrazenecaXylocaïne (Lidocaïne 1 % + Épinéphrine 1:100 000)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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