एस. ऑरियस बायोफिल्म में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का वर्णमितीय विश्लेषण
Summary
इस पांडुलिपि में, हमने एक उच्च थ्रुपुट विधि की स्थापना की है जिसमें क्षारीय फॉस्फेट क्रियाकलाप को एस. ऑरेयस बायोफिल्म कल्चर में ९६-कूप ऊतक कल्चर प्लेट
Abstract
क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) एक सामान्य एंजाइम है जो प्रोक्योटिक और यूकार्योटिक कोशिकाओं दोनों में व्यक्त किया जाता है । यह बुनियादी पीएच पर कई अणुओं से फॉस्फेट monoesters के hydrolysis catalyzes और फॉस्फेट चयापचय में एक अपरिहार्य भूमिका निभाता है । मनुष्यों में, यूकेरियोटिक एएलपी विभिन्न रोगों, जैसे कि cholestasis और रिकेट्स के निदान में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया एंजाइमी संकेतों में से एक है । में एस. ऑरियस, एएलपी कोशिका झिल्ली पर विशेष रूप से पाया जाता है; यह भी एक स्रावी रूप के रूप में अच्छी तरह से व्यक्त की है । फिर भी, थोड़ा biofilm गठन में अपने समारोह के बारे में जाना जाता है ।
इस पांडुलिपि के उद्देश्य के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय परख विकसित करने के लिए एस में ALP गतिविधि को मापने के aureus biofilm कि प्रोटीन अलगाव की आवश्यकता नहीं है । एक सब्सट्रेट के रूप में पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP) का उपयोग करना, हम एस में एएलपी गतिविधि मापा-९६ में बनाई गई biofilm-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें । गतिविधि ४०५ एनएम absorbance द्वारा मापा घुलनशील प्रतिक्रिया उत्पाद के गठन पर आधारित था । ९६ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट विधि के उच्च थ्र्पुट प्रकृति एएलपी गतिविधि assays के लिए एक संवेदनशील और reproducible विधि प्रदान करता है । एक ही प्रयोगात्मक सेट अप भी अन्य extracellular आणविक मार्करों biofilm गठन से संबंधित उपाय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.
Introduction
क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) को दोनों प्रोक्योटिक और यूक्योटिक कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है । यह विभिन्न अणुओं जैसे न्यूक्लियोटिड्स, प्रोटीन, एल्कलॉइड, फॉस्फेट एस्टर और फॉस्फोरिक अम्ल के एन्हाइड्राइडों से मोनोफॉस्फेट के जल अपघटन को उत्प्रेरित कर सकता है । मनुष्यों में, यूक्योटिक एएलपी जिगर, अस्थि, आंत और अपरा2सहित कई ऊतकों में मौजूद है । यह प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन, कोशिका वृद्धि, अपोप्टोसिस, स्टेम सेल प्रक्रियाओं के साथ-साथ सामान्य कंकाल खनिजीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यूकेयोटिक एएलपी हड्डी में रोगों की उपस्थिति के लिए एक महत्वपूर्ण सीरम संकेतक भी है, जिगर, और अन्य ऊतकों/
प्रोक्योटिक एएलपी में विभिन्न प्रकार के जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाया गया है, जिनमें ई.कोलाई5, एस. ऑरियस6,7 और मिट्टी में कुछ सामान्य रूमेन बैक्टीरिया शामिल हैं । बैक्टीरियल alp गतिविधि कीटनाशकों का पता लगाने में एक बायोसेंसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है, भारी धातुओं9 और बैक्टीरियल संदूषण10. एएलपी की संवैधानिक अभिव्यक्ति के लिए Staphylococci11 की पहचान और Enterobacter12से serratia अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह आगे सुझाव दिया है कि संवैधानिक एएलपी उत्पादन staphylococci13में रोगजनन के साथ सहसंबद्ध है । हालांकि alp अलग सेटिंग्स3,4में अध्ययन किया गया है, अभी तक कम अपनी गतिविधि और biofilms संस्कृतियों में समारोह के लिए सूचना दी है ।
एक biofilm के रूप में अपने मुक्त रहने वाले जीवाणु सेल समकक्ष14की तुलना में एक अलग कार्य बैक्टीरियल जीवन है प्रलेखित किया गया है । एस aureusमें, biofilm के गठन के नैदानिक शर्तों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध और जीर्ण सूजन15,16के लिए खातों की एक किस्म में पहचान की गई है । कई अणुओं को एक biofilm मैट्रिक्स जैसे पॉलिसैकेराइड, प्रोटीन, न्यूकलिक एसिड, और लिपिड में पाया जाना सूचित किया गया था, लेकिन biofilm गठन की व्यवस्था पूरी तरह से14समझ में नहीं है । Biofilm गठन में एएलपी की भूमिका को समझने के लिए, हम ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में एस aureus biofilm और पैरा-nitrophenylphosphate (pnpp) का उपयोग कर alp गतिविधि मापा ।
अणु pnpp एएलपी के लिए एक तैयार करने के लिए उपयोग सब्सट्रेट है और व्यापक रूप से एएलपी गतिविधि6,17,18को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह वर्णमितीय परख पैरा-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (पीएनपीपी) के पैरा-नाइट्रोफीनॉल के रूपांतरण पर आधारित है जिसके परिणामस्वरूप ४०५ एनएम पर एक रंगीन उत्पाद है । इस तरह के रूप में अंय पारंपरिक एएलपी परख, agose जेल के रूप में19ट्रो, गेहूं रोगाणु agglutinin (wga) वर्षण, और wga-hplc20, इस परख अत्यधिक विशिष्ट है, संवेदनशील, प्रतिलिपि करने के लिए आसान है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, उच्च के लिए अनुमति देता है प्रवाह.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारी परख में, हम ALP सब्सट्रेट के रूप में pNPP का इस्तेमाल किया । यह एलिसा के लिए बनाया गया एक काम समाधान है और कोई कमजोर पड़ने की जरूरत नहीं है । एएलपी द्वारा hydrolysis के बाद, एक पीले उत्पाद विकसित करता है और ४०५ ए?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विलियम Rainey हार्पर कॉलेज और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय की सुविधा के लिए इन प्रयोगों का संचालन करने के लिए धन्यवाद । हम भी उनके उदार समर्थन के लिए McGraw हिल फाउंडेशन धंयवाद ।
Materials
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
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