Um Método Laboratorial para Medir o Bocejo Contagioso em Ratos

Summary

O método descrito aqui tem como objetivo obter curvas de contágio de bocejo em pares de ratos machos familiares ou desconhecidos. As gaiolas com furos separados por divisórias desobstruídas ou opacas com (ou sem) furos são usadas para detectar se Visual, olfactory, ou ambos os tipos de sugestões sensoriais podem estimular o contágio do bocejo.

Abstract

A comunicação é um aspecto essencial da vida social animal. Os animais podem influenciar uns aos outros e se reúnem em escolas, rebanhos e rebanhos. A comunicação também é a forma como os sexos interagem durante o namoro e como os rivais resolver disputas sem lutar. No entanto, existem alguns padrões comportamentais para os quais é difícil testar a existência de uma função comunicativa, pois vários tipos de modalidades sensoriais provavelmente estão envolvidos. Por exemplo, o bocejo contagioso é um ato comunicatório em mamíferos que potencialmente ocorre através da visão, audição, cheiro, ou uma combinação desses sentidos, dependendo se os animais são familiares uns aos outros. Portanto, para testar hipóteses sobre o possível papel comunicatório de tais comportamentos, é necessário um método adequado para identificar as modalidades sensoriais participantes.

O método proposto aqui visa obter curvas de contágio de bocejo para ratos familiares e desconhecidos e avaliar a participação relativa de modalidades sensoriais visuais e olfatórios. O método usa materiais baratos, e com algumas pequenas alterações, ele também pode ser usado com outras espécies de roedores, como camundongos. Globalmente, o método envolve a substituição de divisores claros (com ou sem furos) com divisores opacos (com ou sem furos) que permitem ou impedem a comunicação entre ratos colocados em gaiolas adjacentes com furos em lados adjacentes. Conformemente, quatro circunstâncias podem ser testadas: uma comunicação olfactory, uma comunicação visual, uma comunicação visual e olfactory, e nem uma comunicação visual nem olfactory. Como a interação social ocorre entre os ratos, essas condições de teste simulam o que pode ocorrer em um ambiente natural. A este respeito, o método proposto aqui é mais eficaz do que os métodos tradicionais que dependem de apresentações de vídeo cuja validade biológica pode suscitar preocupações. Não obstante, não discrimina entre o papel potencial da audição e os papéis do cheiro e da visão no contágio do bocejo.

Introduction

Tradicionalmente, o comportamento comunicatório tem sido estudado a partir de duas perspectivas. De uma perspectiva, os etologistas observam e registram o comportamento dos animais em configurações naturais e tentam reconhecer seu valor adaptativo¹. O sentido particular ou os sentidos envolvidos não foram o interesse preliminar destes estudos. De outra perspectiva, os fisiologistas estão mais interessados em desvendar os mecanismos pelos quais os animais se comunicam¹; assim, estudos laboratoriais têm proporcionado métodos para abordar o papel que as modalidades sensoriais desempenham na comunicação^2,3. Essas duas perspectivas são de fato complementares, pois o conhecimento do valor adaptativo e dos mecanismos imediatos é necessário para obter uma compreensão compreensiva dos comportamentos comunicatórios na vida social dos animais.

O comportamento de bocejo é um componente conspícuo do repertório comportamental em várias espécies de vertebrados⁴, variando de peixes a primatas⁵. Pode ser descrita como uma abertura lenta da boca e manutenção de sua posição aberta, seguida por um fechamento mais rápido da boca⁵. A duração de toda a sequência depende da espécie; por exemplo, primatas bocejam para durações mais longas do que as espécies não-primatas⁶. Em muitas espécies, sendo os seres humanos a exceção, os machos tendem a bocejar mais freqüentemente do que as fêmeas⁷. Esta característica pôde sustentam a função comunicatory possível de bocejar, embora os testes padrões regulares do bocejo e de sua freqüência diária possam igualmente sugerir uma função physiological. Em ratos, o bocejo espontâneo segue um ritmo circadiano, com picos de alta freqüência ocorrendo na manhã e tarde^8,9.

Uma característica interessante do comportamento de bocejo é que pode ser um ato contagioso (quando o estímulo liberador de um comportamento passa a ser outro animal se comportando da mesma forma¹⁰) em várias espécies de vertebrados^{11,12, 13,14,15,16}, incluindo pássaros¹⁷ e roedores¹⁸. Além disso, evidências recentes indicaram que o bocejo contagioso pode refletir um papel comunicatório, pois o bocejo de um rato pode afetar o estado fisiológico de outro quando exposto a pistas olfativas¹⁹. No entanto, se o bocejo tem ou não um papel comunicatório ainda está em debate^20,21, e analisando o bocejo contagioso é um primeiro passo essencial para resolver esta questão.

Por outro lado, o bocejo contagioso tem sido ligado à capacidade de um animal de empatia com as perspectivas de outros animais; Portanto, indivíduos estreitamente relacionados são mais propensos a mostrar contágio⁴. Esta hipótese tem sido freqüentemente testada em condições laboratoriais em que os animais são apresentados com estímulos de bocejo no vídeo^12,13; Portanto, o contágio só pode ocorrer através de pistas visuais. Outras investigações avaliaram o contágio de bocejo em condições mais naturais usando grupos de animais^14,15. Um grande problema disso é que os animais socialmente interagindo muitas vezes respondem a pistas e sinais de troca que são transmitidos através de combinações de modalidades sensoriais. Desentangling os sentidos reais envolvidos em um determinado comportamento de seus efeitos combinados nem sempre é uma tarefa fácil. Tipicamente, os pesquisadores dificultam farmacologicamente ou cirurgicamente o uso de um animal de um determinado senso, então inferem o papel desse sentido no comportamento relevante^2,3,18,22. Felizmente, existem outros métodos em que apenas barreiras físicas são usadas para permitir ou impedir a comunicação entre os animais²³,^24,25, obtendo assim maior validade biológica.

O método proposto aqui foi projetado especificamente para estudar o bocejo contagioso em ratos familiares e desconhecidos em um ambiente social. De acordo com a hipótese empática, o primeiro grupo deve ser mais suscetível ao bocejo contagioso. O método não exige que os animais sejam cirurgicamente ou farmacologicamente privados de quaisquer sentidos. Em vez disso, ele funciona colocando os ratos em gaiolas adjacentes com furos e obstruindo fisicamente sua comunicação usando divisores claros ou opacos com ou sem furos. Assim, quatro condições de teste podem ser examinadas: (1) Comunicação olfativa (OC, divisor opaco perfurado), (2) comunicação visual (VC, divisor claro não perfurado), (3) comunicação visual e olfativa (VOC, divisor claro perfurado) e (4) nem comunicação visual e olfatória (NVOC, divisor opaco não perfurado). Conseqüentemente, os investigadores podem comparar as contribuições relativas de olfactory, Visual, e até certo ponto, indicações auditivas no contágio do bocejo. Essa abordagem não é nova, pois métodos semelhantes têm sido utilizados para isolar os sentidos envolvidos em determinados comportamentos comunicatórios em animais como lagartos²³ e camundongos²⁶. Na verdade, Gallup e colegas²⁷ usaram um método semelhante para demonstrar o papel das pistas visuais no bocejo contagioso em budgerigars. As principais características destes métodos são a simulação de um contexto social e o stress mínimo infligido aos animais. Além disso, o uso de animais interagindo aumenta a validade biológica das conclusões.

Existem várias maneiras de medir o bocejo contagioso^25,28. Dr. Stephen E. G. Lea (comunicação pessoal, 2015) nos ajudou a adaptar numericamente um método anteriormente empregado pelos primatólogos^13,14 para uma análise mais precoce dos dados utilizados aqui¹⁸. Apresentado neste protocolo é uma versão melhorada deste método com uma gama mais ampla de aplicações. Consiste na ponderação do número total de bocejos de um rato, dentro e fora de uma janela de tempo dada, pela proporção de tempo de observação correspondente aos bocejos dentro e fora da janela de tempo.

Por exemplo, se se supor que os ratos A e B são observados por 12 min, seu bocejo é gravado ao minuto o mais próximo, e uma janela de tempo de 3 minutos é ajustada para medir bocejo contagioso. Em seguida, as seguintes sequências de bocejos para cada um desses ratos são consideradas: Rat A (0, 0, 0, 1, 0, 0, 2, 0, 0, 0, 2, 1) e Rat B (0, 1, 1, 0, 1, 1, 0, 0, 0, 0,0, 3). Deve-se notar que cada número (0-3) corresponde ao número de bocejos marcados em cada minuto. Para o rato A, durante os minutos 1, 10 e 11 (números em negrito), o rato B não bocejo dentro dos 3 min precedentes (a janela de tempo escolhida) ou dentro desse minuto. Naqueles minutos, um rato bocejos um total de 2 vezes. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A sem nenhum estímulo do bocejo (taxa do bocejo do não-borne-bocejo) é 2/3 (isto é, 0,67 yawns/min). Nos 9 min restantes, o rato B boceja pelo menos uma vez no mesmo minuto ou nos 3 minutos precedentes. Rat a bocejos um total de quatro vezes naqueles 9 min. Conseqüentemente, a taxa do bocejo do rato A em resposta a um estímulo do bocejo (taxa do bocejo do borne-bocejo) é 4/9 (isto é, 0,44 yawns/min). A aplicação do mesmo procedimento para Rat B produz uma taxa de bocejo não pós-bocejo de 2/3 (i.e., 0,66) e taxa de bocejo pós-bocejo de 5/9 (0,55).

Por outro lado, se o bocejo é gravado para o Decimal mais próximo de um minuto, o contágio de bocejo resultará em um tempo pós-bocejo ajustado. Por exemplo, se os seguintes tempos de bocejo forem gravados durante um período de observação de 12 min para os ratos A e B: rato A (2,3, 5,1, 5,8, 10,4, 10,8, 11,1) e Rat B (1,2, 2,4, 4,5, 5,1, 11,2, 11,6, 11,8). Para o rato a, os períodos de tempo sobre que o rato B não bocejo dentro da escala passada de 3 minutos de 0 a 1,2 de minuto e de 8,1 a 11,2 minutos (isto é, 3,1 minutos), que rende um total de 4,3 minutos do tempo do não-borne-bocejo. O número de vezes que um rato bocejos durante esses tempos é três (números em negrito), assim que a taxa de bocejo não-post-bocejo é 3/4.3 (ou seja, 0,69), enquanto a taxa de bocejo pós-bocejo é 3/7.7 (ou seja, 0,38; o denominador de 12-4.3 min). Similarmente, para o rato B, os períodos de tempo sobre que rato A não bocejo dentro dos 3 minutos passados variam de 0 a 2,3 minutos e de 8,8 a 10,4 minutos, que rende um total de 3,9 minutos. O número de vezes que o rato B bocejos dentro daqueles períodos é um, assim que a taxa do bocejo do não-borne-bocejo é 1/3.9 (isto é, 0,25). Consequentemente, a taxa do bocejo do borne-bocejo é 6/8.1 (isto é, 0,74).

Enquanto um fósforo próximo-contemporâneo no comportamento é um critério ideal para demonstrar a presença de um contágio, aspectos como as restrições sobre o que um indivíduo atende, tempo de reação a um estímulo, distribuição do comportamento ao longo do tempo (por exemplo, bocejo pode ocorrer em episódios), e tempo para aclimatizar ao cenário experimental todos dão origem a diferenças de espécies, dificultando a utilização de uma janela de tempo única. Esta pode ser a razão pela qual os pesquisadores usaram janelas de tempo que variam de segundos⁵ a vários minutos¹¹, o que cria problemas ao comparar os resultados²⁸. Por causa disso, propõe-se repetir o procedimento descrito acima para uma série de janelas de tempo para obter curvas de contágio de bocejo e comparar as curvas de contágio de bocejo entre as espécies.

As curvas equivalentes do contágio do bocejo podem ser comparadas distribuindo aleatòria o número de bocejos observados para cada rato sobre o período de observação. Assim, o método proposto para medir o contágio do bocejo oferece dois tipos de controles: a (1) taxa de bocejo ocorrendo fora da janela de tempo (tempo não pós-bocejo) e (2) curva de contágio de bocejo artificial obtida a partir da distribuição aleatória do número de bocejos. Portanto, essa abordagem para analisar o contágio do bocejo é um passo em frente de outros procedimentos, como aqueles que comparam a porcentagem ou frequência de bocejo dentro de uma única janela de tempo àquela que ocorre fora desta janela²⁵, sem ter em conta o quadros de tempos reais. O método é complementado por um programa baseado em R²⁹ para calcular convenientemente e objetivamente a probabilidade de bocejar contagioso para uma ou mais janelas de tempo.

Para ilustrar a utilidade deste método e das vantagens do programa baseado em R, é utilizado um conjunto de dados de um estudo publicado anteriormente¹⁸ . A condição experimental consistiu em 144 ratos machos alocados a uma condição familiar ou desconhecida. Os ratos em cada condição experimental foram subdivididos em quatro subgrupos de nove pares e expostos a qualquer uma das quatro situações de teste descritas acima. Os comportamentos de bocejo dos ratos em cada condição experimental e a situação do teste foram gravados então durante um período de 60 minutos.

Protocol

Os protocolos experimentais e a criação de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais. 1. materiais Encontre uma lista completa dos materiais usados para implementar o método na tabela de materiais. Use a Figura 1 e procure aconselhamento especializado para construir uma tabela em forma de T invertida, gaiolas de observação e divisores de gaiola. Siga as indicações de segurança para o uso de ferramentas a…

Representative Results

Os ratos foram selecionados de uma sublinha previamente produzida de ratos Sprague-Dawley que foram selecionados para o bocejo frequente (aproximadamente 22 bocejos por hora31). No entanto, os nove pares de desconhecidos e nove pares de ratos machos familiares (entre 2,5 e 3 meses de idade) utilizados por situação de teste bocejou aproximadamente 12 vezes por hora, em média18. Portanto, as situações de teste para medir o contágio do bo…

Discussion

Há etapas críticas no método que devem ser levados em conta para obter resultados bem-sucedidos. Ratos familiares devem compartilhar gaiolas domésticas por pelo menos 1,5 meses após o desmame e antes de executar os experimentos. Entretanto, os ratos desconhecidos devem viver em gaiolas Home separadas. Em ambos os casos, os pares de ratos devem vir de diferentes ninhadas, mas ser tão semelhantes na idade possível. Em relação às gaiolas de observação, seus furos devem corresponder àqueles nos divisores, porque…

Materials

Acrylic dividers	Handcrafted	Not available	Two dividers, one clear and one opaque, will have 24 holes each. The other two dividers, one clear and one opaque, will have no holes. See the main text for details of construction.
An R-based program	Benemérita Universidad Autónoma de Puebla	Not available	This is the program used to assess yawn contagion in rats. See the main text for information about the way the program is used.
Data sheets	The user can elaborate them	Not available	These forms will be used for the observer to record the frequency of yawning behaviour by viewing the video recordings. Alternatively, a notebook can be use provided you follow the suggestions given in the main text.
Desktop computer	Any maker	Not available	Make sure the computer has a video card capable of conveniently processing the video recordings of yawning behaviour.
Digital camcorders	Any maker	Not available	They will be used to video record yawning behaviour of each pair of rats; there will be 2 pairs of rats per experimental session.
Flash drive	Any maker	Not available	Each experimental session will last 60 min, and so you will require sufficient memory to store the video recording.
Glass cages	Handcrafted	Not available	Each cage (19 X 19 X 10 cm height) will have 24 holes (0.5 cm diameter) forming three rows in the middle of one of its sides. See the main text for more details about their construction. It is recommended to fabricate one extra cage in case one of them is accidentally broken.
Markers	Sharpie or any other maker	Not available	Permanent markers to number the rats. See the main text to see one way of using painting symbols on the rat's tail.
Pencils	Any maker	Not available	They are used by the observer to record the frequency of yawning. It is important that the observer has previously been trained to recognize yawning behaviour and operate the video player system.
R software	R Development Core Team	Not available	Download R at: http://cran.r-project.org/
Rail-like wooden bars	Handcrafted	Not available	They will be fixed in the middle of the rectangular wooden sheet  forming a track, where a second wooden sheet is placed. See the main text for additional instructions for construction.
Rectangular table	Any maker	Not available	This is the table (approximately 2 x 1 m) where the inverted T-shaped table will be placed for performing the observation of yawning behaviour.
Sprague-Dawley male rats	Any local supplier of laboratory animals	Not available	Nine pairs of male rats per test situation are necessary for each group, familiar and unfamiliar rats, because with this sample size the interindividual variation that might exist in yawning frequency will not severely affect the conclusions drawn from the statistical analysis performed to the data.
Spreadsheet software	Microsoft	Not available	Excel will be the software used to store the yawning recordings initially recorded on the data sheets. Revise the main text for instructions about the recommended way of doing the transcription.
Square filter papers	Any maker	Not available	They are used for covering the cage's bottom.
Tripods	Any maker	Not available	They will be used for fixing the camcorders in front of each pair of observation cages.
Wooden Inverted T-shaped table	Handcrafted	Not available	Read the instructions in the main text to see the way of constructing it. If preferred, a different material to wood can be used. Make sure any material is as resistant as possible to the transmission of ultrasounds, which the rats might use for communication.