Extracellular मैट्रिक्स hydrogels का उपयोग कर सामान्य ऊतक विकिरण प्रभाव का अध्ययन
Summary
इस प्रोटोकॉल ex vivo विकिरण के बाद murine स्तन वसा पैड के decellularization और बाद में hydrogel गठन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
विकिरण ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर के साथ रोगियों के लिए एक चिकित्सा है. स्वस्थ स्तन ऊतक के extracellular मैट्रिक्स (ECM) और प्राथमिक ट्यूमर साइट पर स्थानीय पुनरावृत्ति में अपनी भूमिका पर विकिरण का प्रभाव अज्ञात हैं. यहाँ हम decellularization के लिए एक विधि प्रस्तुत, lyophilization, और ECM hydrogels के निर्माण murine स्तन वसा पैड से व्युत्पन्न. परिणाम decellularization प्रक्रिया की प्रभावशीलता पर प्रस्तुत कर रहे हैं, और rheological मानकों का मूल्यांकन किया गया. GFP- और luciferase लेबल स्तन कैंसर कोशिकाओं hydrogels में समझाया विकिरणित hydrogels में प्रसार में वृद्धि का प्रदर्शन किया. अंत में, phaloidin संयुग्मी धुंधला encapsulated ट्यूमर कोशिकाओं के cytoskeleton संगठन कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था. हमारा लक्ष्य इन विट्रो अध्ययन के लिए hydrogels fabricating के लिए एक विधि पेश है कि vivo स्तन ऊतक वातावरण में नकल और विकिरण के लिए अपनी प्रतिक्रिया के क्रम में ट्यूमर सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए है.
Introduction
कैंसर कोशिकाओं के अधिक प्रसार की विशेषता है जो एपोप्टोसिस से बच सकते हैं और दूर के स्थलों1तक मेटास्टेसाइज भी कर सकते हैं . स्तन कैंसर अमेरिका में महिलाओं के बीच सबसे आम रूपों में से एक है, एक अनुमान के अनुसार 266,000 नए मामलों और 40,000 मौतों के साथ 20182. एक विशेष रूप से आक्रामक और उपप्रकार का इलाज करने के लिए मुश्किल ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर (TNBC), जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर), प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर), और मानव epidermal विकास कारक (HER2) का अभाव है. विकिरण चिकित्सा आमतौर पर स्तन कैंसर में प्रयोग किया जाता है lumpectomy के बाद अवशिष्ट ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, लेकिन TNBC रोगियों के 13% से अधिक अभी भी प्राथमिक ट्यूमर साइट पर पुनरावृत्ति का अनुभव3.
यह ज्ञात है कि विकिरण चिकित्सा मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति को कम करने में प्रभावी है क्योंकि गांठ-उच्छेदन और विकिरण के संयोजन के परिणामस्वरूप स्तनाच्छेदन4के रूप में एक ही दीर्घकालिक अस्तित्व में होता है। तथापि, यह हाल ही में दिखाया गया है कि विकिरण उपचार प्रतिरक्षा समझौता सेटिंग्स5,6में प्राथमिक ट्यूमर साइट के लिए स्थानीय पुनरावृत्ति के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि विकिरण फाइब्रोसिस7को प्रेरित करके सामान्य ऊतक के extracellular मैट्रिक्स (ECM) में परिवर्तन करता है। इसलिए, यह ट्यूमर सेल व्यवहार dictating में विकिरण प्रेरित ECM परिवर्तन की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
रोग8,9का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडलों में विकोलेकृत ऊतकों का प्रयोग किया गया है . ये विकोशिकीय ऊतक ईसीएम संरचना को संरक्षित करते हैं और विवो ईसीएम में परिसर को पुन: स्वरूपित करते हैं। इस विकोशिकित ऊतक ईसीएम को पुनर्गठित ईसीएम हाइड्रोजेल बनाने के लिए आगे संसाधित और पचा जा सकता है जिसका उपयोग कोशिका वृद्धि का अध्ययन करने और10,11कार्य करने के लिए किया जा सकता है . उदाहरण के लिए, इंजेक्शन hydrogels decellularized मानव lipoaspirate से और मायोकार्डियल ऊतक से प्राप्त ऊतक इंजीनियरिंग के गैर इनवेसिव तरीकों के रूप में सेवा की, और porcin फेफड़ों के ऊतकों से व्युत्पन्न एक hydrogel परीक्षण के एक इन विट्रो विधि के रूप में उपयोग किया गया था मध्यस्किले स्टेम सेल लगाव और व्यवहार्यता12,13,14. ईसीएम गुणों पर सामान्य ऊतक विकिरण क्षति के प्रभाव, तथापि, जांच नहीं की गई है.
ईसीएम से व्युत्पन्न हाइड्रोगेल्स में विवो परिघटनाओं के इन विट्रो अध्ययन के लिए सबसे अधिक क्षमता है। कोलेजन, फाइब्रिन, और मेट्रिगेल सहित कई अन्य सामग्रियों का अध्ययन किया गया है, लेकिन ईसीएम13की संरचना को कृत्रिम रूप से पुन: दोहराना मुश्किल है। ईसीएम व्युत्पन्न हाइड्रोगेल्स का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि ईसीएम में एक विशेष ऊतक14,15के लिए आवश्यक प्रोटीन और विकास कारक होते हैं । lumpectomy के दौरान सामान्य ऊतक के विकिरण ECM करने के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण बनता है, और ECM व्युत्पन्न hydrogels इन विट्रो में इस प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि रोग के इन विट्रो मॉडल में और अधिक जटिल और अधिक सटीक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
इस अध्ययन में, हम विकिरण पूर्व vivo करने के लिए murine स्तन वसा पैड (MFPs) के अधीन. एमएफपी को विकोशिकीकृत किया गया और पूर्व-जेल समाधान में बनाया गया। hydrogels एम्बेडेड 4T1 कोशिकाओं, एक murine TNBC सेल लाइन के साथ गठन किया गया. hydrogel सामग्री के rheological गुणों की जांच की गई, और ट्यूमर सेल गतिशीलता hydrogels के भीतर मूल्यांकन किया गया. विकिरणित MFPs से निर्मित hydrogels ट्यूमर सेल प्रसार बढ़ाया. भविष्य के अध्ययन अन्य सेल प्रकार को शामिल करने के लिए कैंसर पुनरावृत्ति के संदर्भ में सेल सेल बातचीत चिकित्सा के बाद अध्ययन करेंगे.
Protocol
Representative Results
Discussion
hydrogel गठन की यह विधि काफी हद तक शुरू ऊतक की मात्रा पर निर्भर है. Murine MFPs छोटे होते हैं, और decellularization प्रक्रिया सामग्री की एक महत्वपूर्ण कमी में परिणाम (तालिका 1) . अंतिम उपज बढ़ाने के लिए इस प्रक्रिया को अधिक ए…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों GFP प्रदान करने के लिए डॉ लौरा एल Bronsart धन्यवाद- और luciferase-4T1 कोशिकाओं, डॉ एडवर्ड एल LaGory पर सलाह के लिए 1-([4-Xylylazo)xylylazo)-2-naphthol धुंधला, डॉ क्रेग एल Duvall IVIS और lyophilometer उपयोग के लिए, और डॉ. उपयोग. इस शोध को #R00CA201304 NIH अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
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