एकल कोशिका संवेदनशीलता प्रदान करना, वास्तविक समय प्रवाह cytometry अद्वितीय है जीने संस्कृतियों के मल्टीमॉडल रिसेप्टर कार्यों यों तो करने के लिए अनुकूल है । वयस्क तंत्रिका संतान कोशिकाओं का उपयोग कर, P2X7 रिसेप्टर समारोह कैल्शियम सूचक डाई द्वारा पता लगाया गया था के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था, इथिडियम ब्रोमाइड ऊपर से transmembrane छिद्र गठन, और फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती का उपयोग कर phagocytosis.
जीवित कोशिका प्रवाह कोशिकामिति का प्रयोग कोशिका जीवविज्ञानी में जैविक प्रक्रियाओं को परिमाणित करने के लिए किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि जिससे लाइव सेल फ्लो cytometry पर विस्तारित करने के लिए वास्तविक समय में P2X7 रिसेप्टर सक्रियण के कई कार्यों का विश्लेषण है । एक समय मॉड्यूल एक प्रवाह cytometer पर स्थापित का उपयोग करना, लाइव सेल कार्यशीलता का आकलन किया जा सकता है और एक निश्चित समय अवधि में प्लॉट करने के लिए कैल्शियम की आमद की कैनेटीक्स का पता लगाने, transmembrane रंध्र गठन, और phagocytosis । इस सरल विधि P2X7 रिसेप्टर के सभी तीन विहित कार्यों के रूप में लाभप्रद है एक मशीन का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, और इकट्ठा डेटा समय पर प्लॉट पूरे रहते सेल जनसंख्या के बजाय एकल सेल रिकॉर्डिंग अक्सर पर जानकारी प्रदान करता है तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पैच-दबाना तरीकों का उपयोग कर प्राप्त की । कैल्शियम का तांता प्रयोग एक कैल्शियम संकेतक डाई का उपयोग करें, जबकि P2X7 pore गठन assays इथियोडियम ब्रोमाइड पर निर्भर करने के लिए उच्च एगोनिस्ट सांद्रता पर गठित transmembrane छिद्र के माध्यम से पारित करने की अनुमति दी जा रही है । पीला-हरा (YG) लेटेक्स मोती का उपयोग करने के लिए phagocytosis उपाय कर रहे हैं । विशिष्ट एगोनिस्ट और विरोधी P2X7 रिसेप्टर गतिविधि के प्रभाव की जांच करने के लिए लागू कर रहे हैं । व्यक्तिगत रूप से, इन विधियों को कैल्शियम चैनल और प्रिन्जिक और मेहतर रिसेप्टर्स की किसी भी संख्या पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । एक साथ लिया, वे कैसे वास्तविक समय लाइव सेल फ्लो cytometry का उपयोग एक तेजी से, लागत प्रभावी, reproducible, और quantifiable विधि P2X7 रिसेप्टर समारोह की जांच करने के लिए है पर प्रकाश डाला ।
प्रिन्जिक सिग्नलिंग का अध्ययन व्यापक और बहुमुखी है, जिसमें सेलुलर फिजियोलॉजी, जैव रसायन और भेषजगुण शामिल हैं । प्रिन्जिक सिग्नलिंग सेलुलर और आण्विक प्रक्रियाओं की एक अनंत संख्या में शामिल है, कैंसर और सेल चक्र विनियमन सेल सेल संचार और स्टेम सेल जीव विज्ञान से; इस तरह के रूप में, वहां अक्सर एक चिकित्सकीय लाभ के लिए प्रिन्जिक सिग्नलिंग मिलाना क्षमता मौजूद है । प्रिन्जिक रिसेप्टर्स के, P2X7 रिसेप्टर कई भड़काऊ शर्तों1के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता के कारण हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण ध्यान प्राप्त हुआ है. विधियों का अध्ययन करने के लिए रिसेप्टर विकसित किया है और वर्षों में अनुकूलित किया गया है इस अनुसंधान की सुविधा2,3,4,5। यहां, हम एक जीवित कोशिका प्रवाह cytometry विधि का वर्णन करने के लिए वयस्क तंत्रिका उपवेंट्रिकुलर क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पल डेंटेट gyrus से व्युत्पन्न कोशिकाओं में P2X7 रिसेप्टर्स के कई कार्यों की जांच ।
P2X7 रिसेप्टर पहले P2Z रिसेप्टर, या ‘ सेल ‘ मौत रिसेप्टर के रूप में वर्णित किया गया था, adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के उच्च सांद्रता के साथ अपने सक्रियण के रूप में एक बड़े ट्रांझिल् स के गठन में परिणाम ९०० दा6तक अणुओं के लिए पारगम्य । यह साइटोस्केलेटल पुनर्विन्यास, ट्रांसझिल्ली छिद्र गठन, और, संभावित, अपोप्टोसिस और/ परंपरागत रूप से, P2X7 के इस समारोह में बड़े आणविक वजन रंजक जैसे यो प्रो-1 या इथियोडियम bromide, जो fluoresce जब डीएनए3,8के साथ अंतर्विष् ट द्वारा मात्रा निर्धारित है । थाली पाठक तरीके, जो तेजी से कर रहे है और upscaling के लिए अनुमति देते हैं, आम तौर पर कैनेटीक्स के अवलोकन के लिए अनुमति नहीं है । यहां वर्णित विधि इथियोडियम तेज पर आधारित है और प्रतिदीप्ति वृद्धि समय के साथ मनाया जा करने के लिए अनुमति देता है, ताकना गठन की गति के संबंध में जानकारी की एक बड़ी गहराई प्रदान । P2X7 रिसेप्टर्स के बाद से गैर प्रतिरक्षा कार्यों की एक संख्या की सुविधा के लिए दिखाया गया है, अलग जोखिम समय और एगोनिस्ट एकाग्रता9,10के आधार पर प्रतिक्रियाओं के साथ. न्यूरोट्रांसमीटर और सिग्नल पारक्रमण के प्रयोजनों के लिए धनायन आमद में एटीपी परिणामों की कम सांद्रता द्वारा संक्षिप्त सक्रियण11. कैल्शियम की आमद को मापने के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग बोझिल और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तरीकों से जुड़ी समस्याओं पर काबू पाता है-विशेष रूप से, पैच clamping आवक धाराओं को मापने के लिए जो में क्षमता परिवर्तन के रूप में अमूल्य विवरण प्रदान एक कोशिका झिल्ली लेकिन जनसंख्या विश्लेषण2के लिए अनुमति नहीं है । P2X7 रिसेप्टर्स के तीसरे समारोह एटीपी, जहां P2X7 रिसेप्टर्स दोनों प्रतिरक्षा प्रणाली और तंत्रिका तंत्र9,12,13में phagocytosis की सुविधा के लिए प्रदर्शन किया गया है के अभाव में होता है । माइक्रोस्कोपी तकनीकों में प्रगति, हालांकि परिमाणन और जनसंख्या विश्लेषण अभी भी एक चुनौती पेश कर सकते हैं, फिर से शुरू करने की प्रक्रिया के दौरान साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था के दृश्य की अनुमति दी है ।
लाइव सेल फ्लो cytometry विधि यहां विस्तृत वास्तविक समय में P2X7 रिसेप्टर्स के सभी तीन मुख्य कार्यों की जांच के लिए अनुमति देता है । प्रवाह cytometer पर एक समय मॉड्यूल डिवाइस का समावेश तापमान नियंत्रण और निलंबन में कोशिकाओं के नित्य सरगर्मी की अनुमति देता है । एगोनिस्ट और विरोधी उत्तेगनी एक दूसरे के भीतर दिया जा सकता है, सेलुलर प्रतिक्रिया के निकट निर्बाध माप की अनुमति । यह प्रस्तुत करता है एक तेजी से और सरल विधि को reproducibly जबकि कई परख प्रणालियों के उपयोग से परहेज समारोह यों तो । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी कोशिका प्रकार के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है और विशिष्ट एगोनिस्ट या inhibitors के शामिल किए जाने को देखते हुए अंय रिसेप्टर उपप्रकारों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके गुणों पर निर्भर करता है ।
इस पत्र के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत तंत्रिका संतान कोशिका संस्कृतियों में P2X7 रिसेप्टर समारोह के वयस्क न्यूरोजेनिक niches से व्युत्पंन । वयस्क तंत्रिका संतति कोशिकाओं के लिए संभावित अनुप्रयोगों के अनुसंधान से चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए सीमा है, और इसलिए संस्कृति की विधि मजबूत और reproducible होना चाहिए । समापन बिंदु culture की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते है जो इस प्रोटोकॉल के लिए कुंजी पहलुओं की एक संख्या है । एक बार खोपड़ी से हटा दिया, मस्तिष्क सूखी और विच्छेदन के रूप में संभव के रूप में जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । विशेष रूप से हिप्पोकैंपस के साथ, अतिरिक्त देखभाल के लिए किसी भी रक्त वाहिकाओं या झिल्ली ऊतक हटाने के लिए बेहतर संतान कोशिका पैदावार में परिणाम होगा लिया । वियोजन और tration प्रक्रिया भारी एक संस्कृति में प्राप्त क्षेत्रों की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं; trypsin के साथ ऊष्मायन के दौरान ऊतक आंदोलन-EDTA अधिक सजातीय समाधान में परिणाम होगा । एक P1000 प्लास्टिक पिपेट टिप पर एक आग पॉलिश ग्लास चारागाह पिपेट का उपयोग अत्यधिक सेल मौत को कम करने और परिणामस्वरूप संस्कृति में सुधार की सिफारिश की है । ओवरट्रिटिंग से बचें । इन सावधानियों के बावजूद, प्रक्रिया P0 संस्कृति में मलबे का एक बहुत बना सकते हैं, और संतती कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए, धोने या संस्कृति को खिलाने के क्षेत्रों का गठन किया है जब तक बचा जाना चाहिए ।
हिप्पोकैम्पल और SVZ संस्कृतियों के बीच मतभेद की एक संख्या P0 पर स्पष्ट हो जाएगा । हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों कम क्षेत्रों उपज, और इन आम तौर पर पालन । एक पिपेट टिप का प्रयोग करें धीरे से प्रारंभिक बीतने के लिए क्षेत्रों को लिफ्ट । अनुवर्ती अंश में अनुगामी गोले नहीं देखे गए । ऊतक संस्कृति बोतल के विभिंन ब्रांडों के क्षेत्रों, विशेष रूप से हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों का कारण हो सकता है, पालन करने के लिए और पकवान के तल पर कालोनियों के रूप में विकसित । यह इस प्रोटोकॉल के लिए किसी भी डाउनस्ट्रीम परिणाम में परिवर्तन नहीं पाया गया था, लेकिन निगरानी की जानी चाहिए, और निरंतरता जहां संभव बनाए रखा जाना चाहिए ।
पिछले तरीकों को मापने के लिए इस्तेमाल किया P2X7 रिसेप्टर समारोह, ऐसे पैच clamping के रूप में कैल्शियम तांता रिकॉर्ड करने के लिए, समय लेने वाली और श्रमसाध्य कर रहे है और केवल एक ही सेल के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । यह प्रोटोकॉल एक मशीन का उपयोग कर P2X7 रिसेप्टर्स के सभी तीन मुख्य कार्यों का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और reproducible विधि प्रस्तुत करता है । समय-हल रहते सेल प्रवाह cytometry पूरी जनसंख्या विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और कैल्शियम की आमद की कैनेटीक्स के बारे में जानकारी के साथ शोधकर्ता प्रदान करता है, ताकना गठन, और/ इस के अलावा, प्रवाह cytometry आसानी से मार्कर अभिव्यक्ति पैटर्न और जनसंख्या विश्लेषण सेल आकार या प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर आकलन करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इन प्रयोगों का आयोजन करते समय, अधिक से अधिक कैल्शियम की आमद में अंतर, एथिडियम ऊपर उठाना, या phagocytosis दरों दोहराता के बीच देखा जा सकता है. इस को कम करने के लिए, क्षेत्र आकार, संस्कृति की स्थिति, और खिला शासन अनुरूप होना चाहिए के रूप में कोशिकाओं के स्वास्थ्य प्राप्त परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा । बर्फ पर समय भी डेटा को प्रभावित कर सकते हैं, तो यह सुनिश्चित करें कि सब कुछ समय से आगे तैयार है ताकि बर्फ पर समय कम है । सुनिश्चित करें कि कैल्शियम संकेतक डाई लोडिंग समय के अनुरूप है । एक अंय कारक है कि अधिक से अधिक कैल्शियम रिकॉर्डिंग में बड़ी असंगतताओं के लिए नेतृत्व कर सकते है एटीपी बैचेस के बीच भिन्नता है । एटीपी स्टॉक्स की तैयारी महत्वपूर्ण है, और एक ही प्रयोग के लिए अलग बैच के उपयोग से बचना चाहिए । ATP संगत है सुनिश्चित करने के लिए पुराने और नए बैचेस की तुलना भी अनुशंसित है । P2X7 विरोधी की प्रभावशीलता भी हो सकता है सेल लाइन-और बैच निर्भर है, तो ऊष्मायन बार और सांद्रता के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
यह ध्यान देने योग्य बात है कि कैल्शियम की आमद/एफलक्स सबसे मौलिक और जटिल सेलुलर कार्यों में से एक है और कई रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है । एटीपी प्रेरित कैल्शियम का तांता, P2X7 चैनल के लिए एक क्लासिक माप के रूप में/ताकना समारोह, P2X7 रिसेप्टर्स के सही समारोह को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं, के रूप में एटीपी भी P2Y रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए intracellular कैल्शियम जारी कर सकते हैं. इस मामले में, बेरियम के बजाय कैल्शियम का उपयोग करने के लिए एक बेहतर धनायन हो सकता है के रूप में अपनी आमद यूनिडायरेक्शनल16है । कैल्शियम की आमद में P2Y रिसेप्टर्स से योगदान को अंतर करने के लिए, जहां 1 मिमी EDTA या एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-aminoethyl ईथर)-N, n, N ′, N′-tetraacetic एसिड (EGTA) के बजाय केसीएल2 के माध्यम से कश्मीर में जोड़ा जाता है इस में इस्तेमाल किया जा सकता परख.
इस प्रोटोकॉल को भी आसानी से अंय सेल प्रकार के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है और वैकल्पिक आयन चैनल रिसेप्टर्स या रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है कि phagocytosis में भाग लेते हैं । इस विधि भी एक समय मॉड्यूल के बिना एक प्रवाह cytometry मशीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, फैगोसाइटोसिस assays प्रदर्शन किया जा सकता है जहां YG मोती जोड़ रहे है 7-8 मिनट पारंपरिक प्रवाह cytमिति द्वारा विश्लेषण से पहले । ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखो और लगातार उंहें घूमता । यह वास्तविक समय जानकारी प्रदान नहीं करेगा, लेकिन मतलब अंतिम प्रतिदीप्ति में अंतर अभी भी P2X7 रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता के बारे में शोधकर्ता को सूचित करेंगे ।
एक दवा लक्ष्य21,22 के रूप में या यहां तक कि एक दवा वितरण मार्ग के रूप में P2X7 रिसेप्टर्स में ब्याज23,24 तेजी से बढ़ रहा है, और इस रहस्यमय रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए तरीकों को लगातार अनुकूलित किया जाना चाहिए और पर सुधार करने के लिए इन अध्ययनों की सुविधा । इस प्रोटोकॉल के तरीके कि वयस्क तंत्रिका संतति कोशिकाओं में P2X7 समारोह का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है रूपरेखा, और यह आशा व्यक्त की है कि न्यूरोजेनिक niches में P2X7 रिसेप्टर्स की एक बड़ी समझ को प्राप्त करने स्ट्रोक के उपचार में प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और अंय इस्कीमिक चोटों ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस शोध में उनके योगदान के लिए मारिया काशेर्मन और Xin हुआंग का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । यह काम M.W., T.C.L., और एमएल के लिए रेबेका एल कूपर मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) से T.C.L. करने के लिए (५७११०० और १०४८०८२) और Baxter चैरिटेबल फाउंडेशन ( सिडनी, ऑस्ट्रेलिया). बीजी वर्गीज को ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) फ्यूचर फैलोशिप (FT120100581), एनएचआरसी परियोजना अनुदान (१०४८०८२, १०६१४१९ और ११२००९५) और विक्टोरियन सरकार के फ्लोरे संस्थान को प्रचालनात्मक अवसंरचना सहायता अनुदान द्वारा सहायता प्रदान की गई । एमएल एक चार्ल्स डी केल्मन, एमडी Postdoctoral पुरस्कार (२०१०) अंतरराष्ट्रीय रेटिना रिसर्च फाउंडेशन (यूएसए) से समर्थन किया था ।
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |