Materiale dannelse af rekombinante Spider Silks gennem vandig Solvation ved hjælp af varme og tryk
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at producere vandopløselige rekombinant edderkop silke protein løsninger og de materiale former, der kan dannes fra disse løsninger.
Abstract
Mange edderkopper producerer syv typer af Silks. Seks af silkene er fiber i form, når de produceres af edderkopper. Disse fibre er ikke vandopløselige. For at reproducere de bemærkelsesværdige mekaniske egenskaber af edderkoppe silke, skal de produceres i heterologe værter, da edderkopper er både territoriale og kannibalistiske. De syntetiske analoler af edderkop silke har også tendens til at være uopløselige i vandige opløsninger. Således, en stor procentdel af forskning i rekombinant edderkop Silks stole på organiske opløsningsmidler, der er skadelige for storskalaproduktion af materialer. Vores gruppes metode tvinger sollen af disse rekombinante edderkoppe Silks i vand. Bemærkelsesværdigt, når disse proteiner er tilberedt ved hjælp af denne metode til varme og tryk, en bred vifte af materiale former kan fremstilles af den samme opløsning af rekombinante Spider silke proteiner (rSSp) herunder: film, fibre, svamp, hydrogel, lyogel, og klæbemidler. Denne artikel demonstrerer produktionen af den solverede rSSp og materiale formularerne på en måde, der er lettere at forstå end fra skriftlige materialer og metoder alene.
Introduction
Spider Silks har høstet interesse for materialevidenskabsfolk for deres imponerende kombination af styrke, elasticitet og biokompatibilitet. Genskaber fibre har traditionelt været essensen af forskningen. Denne indsats blev hæmmet af den rekombinante edderkop silke protein (rssp) Opløselighed i vand samt manglende evne til traditionelle solvatisering teknikker (chaotrope midler og rengøringsmidler) for at opnå vandig solvatisering. Yderligere, teknikker, der er blevet udviklet til opløsnings versioner af rssp virker ikke på alle rssp varianter og kræver også betydelig manipulation og tid, der ofte resulterer i protein tab1,2. Dette har i høj grad resulteret i området udnytter 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluisopropanol (HFIP) som et opløsningsmiddel, hvorfra man kan danne fibre, og andre begrænsede materiale former. Fordelen er, at alle kendte rSSp er opløselige i HFIP, hvilket giver data ensartethed mellem hver forskningsgruppe. Ulempen er, at HFIP er et giftigt opløsningsmiddel, der er dyrt og upraktisk at skalere på grund af sundhedsmæssige betænkeligheder og miljømæssige hensyn.
Der blev udviklet en ny tilgang til rssp-solvatisering, som byggede bro over den teknologiske kløft mellem det barske organiske opløsningsmiddel hfip og andre teknikker, der selektivt arbejdede for rssp-solvatisering. Kombinationen af specifikke opvarmer og tryk blev anvendt på suspensioner af rssp og vand. Resultaterne var nær 100% solvatisering og genvinding af rssp samt høje proteinkoncentrationer; en række forskellige materialer former blev fast besluttet på at være muligt fra disse formuleringer, som ikke var alle opnåelige ved hjælp af hfip eller andre organiske opløsningsmidler3,4,5,6. Formålet med denne fremgangsmåde er effektivt og let at opløse rensede og tørrede rekombinante Spider-proteiner i en vandig opløsning, der derefter kan anvendes til fremstilling af en række forskellige materiale former.
Fibre, film, belægninger, klæbemidler, hydrogeler, lyogler, mikrokugler og svampe materialer er alle let at skelne fra den samme vandige rSSp-løsning ved hjælp af denne metode. Den fortsatte udvikling af denne metode, ikke kun med yderligere rSSp, men med andre proteiner, kan føre til nye materiale former og alternativ protein rensning og opløseligheds veje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter rekombinant edderkop silke proteiner renses de skal derefter forberedes i en opløsning, der kan bruges til materiale dannelse. Ved at blande lyofiliseret edderkop silke protein med vand og udsætte denne blanding til mikrobølge bestråling, for at generere varme og tryk, er det muligt at forberede en rSSp løsning. En bred vifte af materiale former kan fremstilles af denne enkle og effektive metode til rSSp solubilization. Hvert materiale skal være unikt forberedt og forarbejdet for at opnå det ønskede resulta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne taknemmeligt anerkende finansiering fra Utah Science and Technology Research (USTAR) initiativet.
Materials
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochimie. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
