تنقية وزرع الخلايا السلف شذوذ المستمدة اكسوسوميس لتحسين وظيفة القلب في فئران تندب العضلي دوشين
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين وظيفة القلب في فئران ضمور العضلات دوشين عابر بزرع اكسوسوميس المستمدة من الخلايا السلف شذوذ عادي.
Abstract
دوشين ضمور العضلات (DMD) العاشر مرتبطة المتنحية وراثية مرض الناجم عن نقص البروتين ديستروفين الوظيفية. لا يمكن الشفاء من المرض، وكلما تقدم المرض، يطور المريض أعراض المتوسعة اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب، وفشل القلب الاحتقاني. الفئران DMDMDX متحولة لا تعبر عن ديستروفين، وتستخدم عادة كنموذج الفأر من إعلان الدوحة الوزاري. وفي دراستنا الأخيرة، لاحظنا أن حقن إينتراميوكارديال من نوع واسعة (WT)-عابر استعادة السلف شذوذ المستمدة من الخلايا اكسوسوميس (MPC-أكسو) التعبير عن ديستروفين في عضلة القلب الفئران DMDMDX المسخ، الذي ارتبط مع تحسن عابر في وظيفة القلب، مما يوحي بأن وزن-MPC-أكسو قد توفر خيار للتخفيف من أعراض أمراض القلب من إعلان الدوحة الوزاري. توضح هذه المقالة التقنية لتنقية MPC-أكسو وزرعها في قلوب الفئران متحولة DMDMDX .
Introduction
دوشين ضمور العضلات (DMD) العاشر مرتبطة المتنحية، تقدمية العضلية مرض تسببه طفرة في جين DMD وفقدان ديستروفين الفنية1. ديستروفين تتجلى أساسا في العضلات الهيكلية وعضلة القلب، ويتم التعبير عن أقل في العضلات الملساء والغدد الصماء والخلايا العصبية2،3. DMD هو النوع الأكثر شيوعاً من ضمور العضلات مع معدل واحد لكل 3,500 إلى 5,000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم4،5. عادة وضع الأفراد نخر العضلات التدريجي، فقدان المشي المستقلة خلال مرحلة المراهقة المبكرة، والموت في العقود الثانية إلى الثالثة من حياتهم بسبب فشل القلب، وفشل في الجهاز التنفسي6.
المتوسعة اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب الاحتقاني مظاهر القلبية الوعائية شائعة DMD7،8. لا يمكن الشفاء من المرض، والعلاج الداعم قد تحسين الأعراض أو تأخير تطور قصور القلب، ولكن من الصعب جداً لتحسين وظيفة القلب9،10.
مماثلة للمرضى DMD، ضمور العضلات المرتبطة بالعاشر الفئران (MDX) تعاني من نقص في البروتين ديستروفين، وهذا أعراض اعتلال عضلة القلب11، وثم تستخدم على نطاق واسع في البحوث اعتلال عضلة القلب DMD المرتبطة. من أجل استعادة ديستروفين في العضلات المتأثرة، أثبت العلاج بالخلايا الجذعية متمكنة يمكن علاج فعال لإعلان الدوحة الوزاري12،،من1314. اكسوسوميس، شمال البحر الأبيض المتوسط 30-150 غشاء الحويصلات يفرز من مختلف أنواع الخلايا، تلعب دوراً أساسيا في الاتصالات خلية إلى خلية عن طريق نقل المواد الجينية، مثل الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) والترميز غير الكشف15،16،17 ،،من1819،،من2021.
وأظهرت دراساتنا السابقة أن اكسوسوميس المستمدة من الخلايا السلف شذوذ (MPC)، مثل خط الخلية C2C12، يمكن نقل ديستروفين مرناً للمضيف cardiomyocytes بعد22من الحقن المباشر للقلب، مشيراً إلى أن تسليم متمكنة يمكن استعادة اكسوسوميس المستمدة من السياسة النقدية (MPC-أكسو) عابر DMD الجينات في الفئران MDX. تركز هذه المقالة على تقنيات تنقية وزرع MPC-أكسو.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة لعزل اكسوسوميس النقي ضروري لدراسة وظيفة اكسوسوميس. أحد الأساليب الشائعة لعزل اكسوسومي من البولي إيثيلين الجليكول (أوتاد) بوساطة الأمطار17،،من1825. اكسوسوميس يمكن أن تكون عجلت في أوتاد، والقريبون من الطرد المركزي ذات سرعة منخفضة. ت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تانغ كانت تدعمها جزئيا في “جمعية القلب الأمريكية”: GRNT31430008، AR070029 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة-HL086555، HL134354 المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
References
- Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
- Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
- Rae, M. G., O’Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
- Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
- D’Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
- Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
- Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
- Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
- Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
- Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
- Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
- Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
- Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).
- Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381 (2012).
- Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
- Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
- Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
- Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
- Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).
