Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.
Abstract
Duchene Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessive genetische Krankheit verursacht durch einen Mangel an funktionalen Dystrophin-Protein. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, und wenn die Krankheit fortschreitet, entwickelt der Patient Symptome einer dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Die DMDMDX mutierte Mäuse Dystrophin nicht ausdrücklich und werden häufig als ein Maus-Modell der DMD verwendet. In unserer aktuellen Studie beobachteten wir, dass Intramyocardial Injektion von breite Ausführung (WT)-myogen Progenitor Zellen abgeleitet Exosomen (MPC-Exo) vorübergehend restauriert die Expression von Dystrophin im Myokard von DMDMDX mutierten Mäusen, die verbunden WT-MPC-Exo kann eine vorübergehende Verbesserung der Herzfunktion, die darauf hindeutet, dass eine Option, um die kardiale Symptome von DMD zur Verfügung. Dieser Artikel beschreibt die Technik der MPC-Exo-Reinigung und Transplantation in Herzen von DMDMDX mutierten Mäusen.
Introduction
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessiv, progressive neuromuskuläre Erkrankungen verursacht durch eine Mutation in DMD gen und den Verlust der funktionellen Dystrophin-1. Dystrophin drückt sich vor allem im Skelettmuskel und Myokard und weniger drückt sich in endokrinen Drüsen, glatte Muskulatur und Neuronen2,3. DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie mit einer Inzidenz von 1 pro 3.500 bis 5.000 Neugeborenen jungen weltweit4,5. Menschen entwickeln in der Regel progressive Muskelentspannung Nekrose, Verlust des unabhängigen Gehens von frühen Jugend und Tod in der zweiten bis dritten Jahrzehnte ihres Lebens durch Herzversagen und Atemstillstand6.
Dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz sind gemeinsame kardiovaskuläre Manifestationen von DMD7,8. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, unterstützende Behandlung kann Symptome verbessern oder das Fortschreiten der Herzinsuffizienz zu verzögern, aber es ist sehr schwierig, die Herz-Funktion9,10zu verbessern.
Ähnlich wie bei DMD-Patienten, X-chromosomale Muskeldystrophie (MDX) Mäuse haben einen Mangel an Dystrophin-Protein und vorliegenden Symptome einer Kardiomyopathie11und werden daher häufig in DMD verbundenen Kardiomyopathie Forschung eingesetzt. Um das Dystrophin in den betroffenen Muskeln wiederherzustellen, erweist allogene Stammzell-Therapie sich eine wirksame Behandlung für DMD12,13,14. Exosomen, 30-150 nm Membranvesikel abgesondert von verschiedenen Zelltypen, spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation durch genetische Materialtransport wie Boten-RNA (mRNA) und nicht-kodierende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Exosomen abgeleitet myogen Vorläuferzellen (MPC), wie z. B. C2C12 Zelllinie Dystrophin übertragen können mRNA zu Host Kardiomyozyten nach kardialen Direkteinspritzung22, darauf hinweist, dass die allogene Lieferung von MPC-abgeleitete Exosomen (MPC-Exo) können vorübergehend DMD Genexpression in MDX-Mäuse wiederherstellen. Dieser Artikel konzentriert sich auf MPC-Exo-Reinigung und Transplantation-Techniken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Methode der reinen Exosomen zu isolieren ist essentiell für die Funktion der Exosomen zu studieren. Eines der gemeinsamen Techniken für die Exosom Isolierung ist Polyethylen Glykole (PEGs) vermittelte Niederschlag17,18,25. Exosomen können Stifte ausgefällt, und pelleted durch langsame Zentrifugation. PEG-vermittelten Reinigung ist sehr bequem, Low Cost, es braucht keiner vorgerückte Ausrüstung, aber gibt es Bedenken ü…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang waren teilweise unterstützt von der American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
References
- Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
- Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
- Rae, M. G., O’Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
- Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
- D’Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
- Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
- Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
- Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
- Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
- Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
- Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
- Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
- Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).
- Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381 (2012).
- Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
- Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
- Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
- Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
- Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).
