Rensing og transplantasjon av Myogenic stamfar celle avledet Exosomes for å forbedre hjertefunksjon i Duchenne muskel Dystrophic mus

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å forbedre transiently hjertefunksjon i Duchenne muskeldystrofi mus ved transplanting exosomes avledet fra normal myogenic progenitor celler.

Abstract

Duchene muskeldystrofi (DMD) er en X-tilknyttet recessiv genetisk sykdom forårsaket av mangel på funksjonell dystrophin protein. Sykdommen kan ikke kureres, og som sykdommen utvikler seg, pasienten utvikler symptomer Dilaterte kardiomyopati, arytmi og hjertesvikt. DMD^MDX mutant musene uttrykke ikke dystrophin, og blir ofte brukt som en musemodell av DMD. I vår siste undersøkelse, observerte vi at intramyocardial injeksjon av bredt type (WT)-myogenic stamfar celler-avledet exosomes (MPC-Exo) transiently gjenopprettet uttrykk for dystrophin i myokard DMD^MDX mutant mus, som var tilknyttet med en midlertidig forbedring i hjertefunksjon tyder på at kan WT-MPC-Exo gi et alternativ å avlaste kardiale symptomer på DMD. Denne artikkelen beskriver teknikken for MPC-Exo rensing og transplantasjon i hjerter DMD^MDX mutant mus.

Introduction

Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en X-tilknyttet tilbakeslag, progressive nevromuskulær sykdom forårsaket av en mutasjon i DMD gene og tap av funksjonelle dystrophin¹. Dystrophin er uttrykt i skjelettmuskulatur og myokard, og uttrykkes mindre glatt muskel, endokrine kjertler og neurons^2,3. DMD er den vanligste typen muskeldystrofi med en forekomst av en per 3500 til å 5000 nyfødte gutter verden^4,5. Individer utvikler vanligvis progressive muskelavslapning nekrose, tap av uavhengige vandre ved tidlig ungdom, og døde i de andre til tredje tiårene av livet på grunn av hjertesvikt og respirasjonssvikt⁶.

Dilaterte kardiomyopati, arytmi og hjertesvikt er vanlige hjerte manifestasjoner av DMD^7,8. Sykdommen kan ikke kureres, støttende behandling kan forbedre symptomer eller forsinke utviklingen av hjertesvikt, men det er svært vanskelig å forbedre hjertet funksjon^9,10.

Lik DMD pasienter, X-tilknyttet muskeldystrofi (MDX) mus er mangelfull i dystrophin protein og nåværende symptomer på kardiomyopati¹¹, og er derfor mye brukt i DMD forbundet kardiomyopati forskning. For å gjenopprette dystrophin i berørte muskler, fører allogene stilk cellen terapi har vist seg for å være en effektiv behandling for DMD^12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membran blemmer utskilles av ulike celletyper, spiller en viktig rolle i celle til celle kommunikasjon gjennom genetisk materiale transport som budbringer RNA (mRNA) og ikke-koding RNAs^{15,16,17 ,18,19,20,21}.

Våre tidligere studier har vist at exosomes avledet fra myogenic progenitor celler (MPC), for eksempel C2C12 celle linje, kan overføre dystrophin mRNA til verten cardiomyocytes etter direkte cardiac injeksjon²², indikerer at allogene levering av MPC-avledet exosomes (MPC-Exo) kan transiently gjenopprette DMD genuttrykk i MDX mus. Denne artikkelen fokuserer på MPC-Exo rensing og transplantasjon teknikker.

Protocol

Dyrene ble behandlet godkjent protokoller og dyrevelferd forskriftene av institusjonelle Animal Care og bruk komité Medical College of Georgia på Augusta University. 1. isolering og rensing av MPC-avledet Exosomes Frø 5 x 106 C2C12 celler i en 15 cm celle kultur parabol med 20 mL komplett Dulbecco endret Eagle’s medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin G og 100 μg/mL streptomycin. Ruge på 37 ° C og 5% CO2. <li…

Representative Results

Et flytskjema for å isolere og rensende exosomes fra C2C12 celler vises i figur 1A. For å bekrefte tilstedeværelse av exosomes, utført vi overføring elektronmikroskop analyse. Overføring elektronmikroskop bildet (figur 1B) viser morfologi av lyse og rund form blemmer av C2C12 avledet exosomes. Western blot analyse bekreftet tilstedeværelse av exosome markører, inkludert CD63 og TSG101 (figur 1</stron…

Discussion

Metoden isolere ren exosomes er avgjørende for å studere funksjonen til exosomes. En av de vanlige teknikkene for exosome isolasjon er polyetylen glycols (plugger) mediert nedbør^17,18,25. Exosomes kan igangsatte i plugger og pelleted med lav hastighet sentrifugering. PEG-mediert rensing er veldig praktisk, rimelig, det trenger ikke noen avansert utstyr, men det er bekymring for renhet av exosomes siden andre lipoproteiner kan…

Materials

0.22-μm Filter	Fisherbrand	09-720-004
15-cm Cell Culture Dish	Thermo Fisher Scientific	157150
24-gauge catheter	TERUMO	SR-OX2419CA
31-gauge insulin needle	BD	328291
4% paraformaldehyde	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 suture	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Antibiotic Antimycotic Solution	Corning	30-004-CI
Anti-Dystrophin antibody	Abcam	ab15277
Antigen retriever	Aptum Biologics	R2100-US	Antigen recovery
Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 cell line	ATCC	CRL-1772
Centrifuge	Unico	C8606
Change-A-Tip High Temp Cauteries	Bovie Medical Corporation	HIT
Confocal microscopy	Zeiss	Zeiss 780 Upright Confocal
DBA/2J-mdx mice	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Goat serum	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Ketamine	Henry Schein	056344
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Mouse Retractor Set	Kent Scientific	SURGI-5001
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fisher Scientific	BP151-100
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Ti rotor	Beckman	342207
The Vevo 2100 Imaging Platform	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100	Ultrasound System
Ultracentrifuge	Beckman	365672
Ultra-Clear Tubes	Beckman	344058
Xylazine (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006