Очистка и трансплантация миогенных прогениторных клеток производные Exosomes для улучшения сердечной функции мышечной дистрофические мышей Дюшенна
Summary
Здесь мы представляем протокол временно улучшить функции сердца в мышах мышечная дистрофия Дюшенна, трансплантация exosomes, производные от нормальных миогенных прародитель клеток.
Abstract
Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) является Х-сцепленный рецессивный генетическое заболевание вызвано отсутствием функциональной делеций белка. Болезнь нельзя вылечить, а как болезнь прогрессирует, пациент развивает симптомы Дилатационная кардиомиопатия, аритмии и застойной сердечной недостаточности. ДМДMDX мутантных мышей не выражают делеций и широко используются как мыши модель DMD. В нашем недавнем исследовании, мы наблюдали что intramyocardial инъекции широкий типа (WT)-миогенных прогениторных клеток, полученных exosomes (MPC-Exo) временно восстановлен выражение делеций в миокарде DMDMDX мутантных мышей, который был связан с временным улучшением функции сердца, предполагая, что WT-MPC-Exo может предоставить возможность для облегчения сердечных симптомов DMD. Эта статья описывает технику MPC-Exo очищения и трансплантации в сердцах DMDMDX мутантных мышей.
Introduction
Мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) является Х-хромосомой рецессивных, прогрессивный нервно-мышечные заболевания вызванные мутация в гене DMD и потере функциональных делеций1. Делеций выражается главным образом в скелетных мышцах и миокарда и менее выражена в гладкие мышцы, железы внутренней секреции и нейроны2,3. DMD-это наиболее распространенный тип мышечной дистрофии с заболеваемостью одному 3500 до 5000 новорожденных мальчиков во всем мире4,5. Люди обычно развиваются прогрессивная мышечная некроза, потеря независимых мимо раннего подросткового возраста и смерть в второй-третьей декадах их жизни из-за сердечной и дыхательной недостаточности6.
Расширенная кардиомиопатия, аритмии и застойной сердечной недостаточности являются проявлением DMD7,8общих сердечно-сосудистой системы. Болезнь нельзя вылечить, поддерживающее лечение может улучшить симптомы или задержать прогрессирование сердечной недостаточности, но это очень трудно улучшить сердце функции9,10.
Похож на ДМД пациентов, Х-хромосомой мышечная дистрофия (MDX) мышах дефицит белка делеций и настоящем симптомы кардиомиопатия11и поэтому широко используются в ДМД связанные кардиомиопатия исследований. Чтобы восстановить делеций в пораженных мышц, аллогенных стволовых клеток оказалось эффективным средством лечения для ДМД12,,1314. Exosomes, 30-150 Нм мембрана везикулы выделяемый различных типов клеток, играют ключевую роль в области коммуникации к ячейке посредством генетического материала транспорта, таких как матричная РНК (мРНК) и некодирующих RNAs15,16,17 ,18,19,,2021.
Наши предыдущие исследования показали, что exosomes, производные от миогенных прогениторных клеток (ПДК), например C2C12 клеточной линии, могут передавать делеций мРНК в принимающей кардиомиоцитов после прямого впрыска сердца22, указывающее что аллогенной доставки MPC-производные exosomes (MPC-Exo) может временно восстановить DMD экспрессии генов мышей многомерных выражений. Эта статья посвящена методам очистки и трансплантации MPC-Экзо.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод изоляции чисто exosomes имеет важное значение для изучения функции exosomes. Один из распространенных методов для exosome изоляции является полиэтиленгликолей (шпеньки) при посредничестве осадков17,18,25. Exosomes может быть химически осажденный …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Тан были частично поддержаны американской ассоциации сердца: GRNT31430008, низ-AR070029, низ-HL086555, низ-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
References
- Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
- Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
- Rae, M. G., O’Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
- Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
- D’Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
- Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
- Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
- Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
- Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
- Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
- Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
- Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
- Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).
- Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381 (2012).
- Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
- Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
- Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
- Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
- Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).
