Rening och Transplantation av Myogenic Progenitor Cell härrör Exosomes för att förbättra hjärtfunktionen i Duchennes muskulös dystrofa möss
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att förbättra normalnivå hjärtfunktion hos Duchennes muskeldystrofi möss genom omplantering exosomes härrör från normala myogenic stamceller.
Abstract
Duchene muskeldystrofi (DMD) är en X-bunden recessiv genetisk sjukdom orsakas av en brist på funktionella dystrofin protein. Sjukdomen kan inte botas, och eftersom sjukdomen fortskrider, patienten utvecklar symtom av dilaterad kardiomyopati, arytmi och hjärtsvikt. DMDMDX muterade mössen uttrycker inte dystrofin, och används ofta som en musmodell av DMD. I vår senaste studie, vi konstaterade att intramyocardial injektion av brett typ (WT)-myogenic progenitor celler-derived exosomes (MPC-Exo) övergående återställd uttrycket av dystrofin i myokardiet av DMDMDX muterade möss, som förknippades med övergående förbättring av hjärtfunktionen tyder på att föreskriva WT-MPC-Exo en möjlighet att lindra hjärt symptomen av DMD. Denna artikel beskriver tekniken av MPC-Exo rening och transplantation in i hjärtan av DMDMDX muterade möss.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en X-bunden recessiv, progressiv neuromuskulär sjukdom orsakas av en mutation i genen DMD och förlusten av funktionella dystrofin1. Dystrofin uttrycks framförallt skelettmuskulatur och hjärtmuskeln och uttrycks mindre i glatt muskulatur, endokrina körtlar och nervceller2,3. DMD är den vanligaste typen av muskeldystrofi med en incidens av en per 3 500 till 5.000 nyfödda pojkar världen över4,5. Individer utvecklar vanligen progressiva muskel nekros, förlust av oberoende walking av tidiga tonåren, och död i andra till tredje årtionden av sina liv på grund av hjärtsvikt och andningssvikt6.
Dilaterad kardiomyopati, arytmier och hjärtsvikt är vanligt hjärt-manifestationer av DMD7,8. Sjukdomen kan inte botas, understödjande behandling kan förbättra symtom eller fördröja utvecklingen av hjärtsvikt, men det är mycket svårt att förbättra hjärtat funktion9,10.
Liknar DMD patienter, X-länkade muskeldystrofi (MDX) möss är bristfällig i dystrofin protein och nuvarande symtom på kardiomyopati11, och används därför ofta i DMD associerade kardiomyopati forskning. För att återställa dystrofin i drabbade muskler, har allogen stamcellsterapi visat sig vara en effektiv behandling för DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membranet blåsor utsöndras av olika celltyper, spela en nyckelroll i cell-till-cell kommunikation genom genetiska materialtransport, såsom budbärar-RNA (mRNA) och icke-kodande RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Våra tidigare studier har visat att exosomes härstammar från myogenic stamceller (MPC), såsom C2C12 cellinje, kan överföra dystrofin mRNA till värd hjärtmuskelcellerna efter hjärt direktinsprutning22, vilket indikerar att allogen leverans av MPC-derived exosomes (MPC-Exo) kan övergående återställa DMD genuttryck i MDX-möss. Denna artikel fokuserar på MPC-Exo rening och transplantation tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden att isolera ren exosomes är viktigt för att studera funktionen av exosomes. En av de vanliga teknikerna för exosome isolering är polyeten glykoler (pinnar) medierad nederbörd17,18,25. Exosomes kan vara fällt i pinnar och pelleterat låg hastighet centrifugering. PEG-medierad rening är mycket bekvämt, låg kostnad, det behöver inte någon avancerad utrustning, men det finns oro över renheten hos exosomes efterso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang stöttades delvist av American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
References
- Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
- Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
- Rae, M. G., O’Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
- Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
- D’Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
- Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
- Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
- Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
- Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
- Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
- Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
- Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
- Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).
- Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381 (2012).
- Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
- Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
- Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
- Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
- Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).
