マウスの腫瘍増殖を減少させるマイクロRNAの生体内阻害
Summary
このプロトコルは、ヒト甲状腺腫瘍形成の異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを、マイクロRNAベースの阻害剤治療を試験するプラットフォームとして説明する。このアプローチは、非コードRNAの機能と新しい治療標的としての可能性を研究するのに理想的です。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、mRNAを不安定化させ、標的mRNAの翻訳を阻害する能力を通じて遺伝子発現の重要な調節剤です。増え続ける研究により、miRNAはがん診断や予後の潜在的なバイオマーカーとして、また治療目標として、がんの評価と治療に余分な次元を追加しました。甲状腺癌の文脈では、腫瘍形成は重要な遺伝子の突然変異からだけでなく、多くのmiRNAの過剰発現からも生じる。従って、甲状腺遺伝子発現制御におけるmiRNAの役割は、がんにおける重要なメカニズムとして進化しつつある。本明細書では、ヒト腫瘍異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを用いて甲状腺癌における治療モダリティとしてのmiRNA阻害剤送達の効果を調べるプロトコルを提示する。GFPとルシフェラーゼを発現する安定した甲状腺腫瘍細胞を工学した後、細胞をヌードマウスに注入して腫瘍を発症させ、その後に生物発光を行うことができる。miRNAのインインインイン阻害は、腫瘍増殖を減少させ、miRNA遺伝子標的をアップカビギュレートすることができる。この方法は、新しい治療標的を同定することに加えて、生体内で決定されたmiRNAの重要性を評価するために使用することができる。
Introduction
甲状腺癌は内分泌悪性腫瘍であり、一般的には良好な結果1を有する。それにもかかわらず、一部の患者は治療不可能な疾患の積極的な形態を開発し、分子塩基は十分に理解されていない2.
miRNAは、多くの組織で遺伝子発現を調節する22ヌクレオチド長い非コードRNAであり、典型的には標的メッセンジャーRNA(mRNA)の3’非翻訳領域(3’UTR)に結合することにより、mRNAの分解または翻訳抑圧を引き起こす。3,4.これらの分子が増殖シグナル伝達、移動、侵入および転移を調節し、アポトーシスに対する耐性を提供することができるので、マイクロRNA発現の調節が癌の特徴であることを示す証拠が増えている。5,6.近年、多くの研究では、がんの診断や予後の潜在的なバイオマーカーとしてmiRNAを同定し、治療目標7と同様に、がんの評価と治療に新たな次元を提供しています。
miRNAは、ヒト甲状腺新生物8、9、10、11、12の主要な推進要因としてヒト分子腫瘍学の中心的な段階をとってきた。miRNAアップ規制の中で、miR-146bは乳頭甲状腺癌(PTC)腫瘍において非常に過剰発現され、細胞増殖を有意に増加させ、攻撃性および陰気な予後6と関連することが示された。12歳,13歳,14歳,15.さらに、miR-146bは、分化12に関与するいくつかの甲状腺遺伝子、ならびにPTEN16およびDICER117などの重要な腫瘍抑制遺伝子を調節する。がん生物学における重要性にもかかわらず、miRNAベースの癌治療はまだ初期段階にあり、甲状腺癌に対処した研究はほとんどありません – 内分泌腫瘍の中で最も頻繁に18。ここでは、ヒト由来腫瘍を有する2つの異なるマウスモデルを用いたプロトコルについて説明し、細胞miRNAを特異的に阻害する合成miRNA阻害剤(antagomiR)の投与が腫瘍増殖をブロックできる。我々は最初に共通の異種移植片モデルを用いて、そして、腫瘍生物発光の減少として測定された腫瘍増殖を減少させたアンタゴミRの局所的な腫瘍内投与16。ヒト腫瘍の進行を模倣する堅牢なマウスモデルの確立は、独自の治療アプローチを開発するために不可欠であるため、原発性ヒト腫瘍の局所移植は、新薬の臨床検証のためのより貴重なプラットフォームである。皮下注入モデル。したがって、antagomiRの治療可能性をより良く評価するために、血流中の全身送達を伴うオルトトピックマウスモデルを用いて、同じ結果を得た。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、腫瘍の開始と進行におけるその役割と甲状腺癌の治療標的としての可能性をよりよく理解するために、miRNAの生体内機能を研究する方法について述べた。ここで説明する腫瘍異種移植片モデルは、その生物発光シグナルによって追跡することができる細胞の使用に基づいており、治療の影響下で生体内の腫瘍増殖の測定を可能にする。また、現在初期段階にある甲状腺がんに対?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ラケル・アロチャ・リースコがマウスの治療とケアを支援してくれたことに感謝しています。私たちは、J.ブランコ博士(カタロニアのアドバンスケミストリーCSIC研究所)とE.マト博士(インスティトゥート・デ・レセルカ・デ・ラ・サンタ・クルー・イ・サンパウ)バルセロナ(スペイン)に、それぞれCMV-Firefly luc-IRES-EGFPとCal62-Luc細胞を贈りてくださったことに感謝します。
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
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